姚曉東,張?zhí)N慧

目前,原發(fā)性高血壓的發(fā)病率逐年增高,且具有年輕化、多并發(fā)癥等特點。長時間處于高血壓狀態(tài)可導(dǎo)致機體代謝紊亂,認(rèn)為高血壓是導(dǎo)致腦卒中、糖尿病、高血壓性心臟病、腎小球動脈硬化的高危風(fēng)險因素[1-2]。目前,西醫(yī)對高血壓的治療多采用對癥治療策略,即使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、β-受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑、腎髓袢利尿劑等實現(xiàn)針對性的降壓[3-4]。與西藥相比,中藥可通過多成分、多途徑、多靶點調(diào)節(jié)血壓,且具有個體化、毒副作用較小、用藥加減靈活等特點[5-6]。因此,加強中藥在高血壓治療方面的探索研究具有重要的理論及應(yīng)用意義。

高血壓屬于中醫(yī)學(xué)眩暈、頭痛、中風(fēng)等范疇,認(rèn)為高血壓的主要誘因為情志內(nèi)傷、勞倦虛衰、飲食失節(jié),其病機演變過程為肝失疏泄、脾失健運、腎氣虧虛[7],針對高血壓的中醫(yī)學(xué)特征,山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院周次清教授以“從肝腎分期論治高血壓”專病學(xué)術(shù)思想為依托,自擬了補腎和脈方用于高血壓的治療并取得了較好的臨床應(yīng)用療效[8]。但因中藥復(fù)方具有多藥物成分、多干預(yù)途徑、多治療靶點的特點,目前對補腎和脈方藥物成分治療高血壓多靶點協(xié)同機制尚未完全闡明。為此,本研究將圍繞補腎和脈方中杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍5味核心藥物,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補腎和脈方核心中藥改善高血壓的治療機制。

1 資料與方法

1.1 中藥復(fù)方活性成分的收集 登陸中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以“杜仲”“澤瀉”“黃芪”“懷牛膝”“地龍”為關(guān)鍵詞,對上述中藥的化學(xué)成分進(jìn)行檢索。對在TCMSP中能夠檢索到的活性成分,以口服生物利用度(OB)>30%且類藥性(DL)>0.18為條件,篩選得到杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍5味中藥的活性成分。

1.2 藥物成分對應(yīng)靶點的收集 根據(jù)檢索獲得的杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍活性成分,分別在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得其成分對應(yīng)的靶點蛋白,并在PubChem數(shù)據(jù)庫下載各活性成分分子結(jié)構(gòu)式,將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swiss targetprediction.ch/)及SEA數(shù)據(jù)庫(https://sea.bkslab.org/)進(jìn)行靶點預(yù)測并上傳至UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點信息,即得到杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍活性成分作用靶點。

1.3 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍治療高血壓的潛在靶點獲取 通過OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)及DrugBank數(shù)據(jù)庫(www.drugbank.ca/),以“hypertension”為關(guān)鍵詞檢索及去重后獲得高血壓相關(guān)靶點?；谠诰€軟件Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍活性成分的作用靶點及高血壓相關(guān)靶點取交集,兩者共有的靶點即是杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓的潛在作用靶點。

1.4 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 整理杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓的潛在干預(yù)靶點及其對應(yīng)的藥物成分,并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,獲得杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方藥物成分-高血壓干預(yù)靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。在Cytoscape 3.9.0軟件中計算出關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的每個節(jié)點的度值(Degree),其值越大,認(rèn)為可作用于該靶點的活性成分越多。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析 將杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓的潛在靶點導(dǎo)入STRING 11.5(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中,設(shè)定最高置信度為0.9,獲取網(wǎng)絡(luò)信息;將網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,使用Cytohub插件計算介數(shù)中心性(betweenness,BC),并構(gòu)建PPI核心子網(wǎng)絡(luò),篩選出杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓的核心靶點。

1.6 基因富集分析 在R 3.5.0軟件中,基于clusterProfiler包,對篩選得到的杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓的潛在靶點進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。以P<0.05且P-adjust<0.05為篩選條件,分別選取富集前20位的GO條目及KEGG通路。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方活性成分及其靶點 對杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方中每味中藥的成分進(jìn)行篩選后,獲得杜仲活性成分28個、澤瀉8個、黃芪18個、懷牛膝18個、地龍4個,部分活性成分結(jié)果見表1。剔除重復(fù)或者無固定結(jié)構(gòu)信息的成分后,得到杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方的活性成分共70個,再將70個活性成分在TCMSP、SwissTargetPrediction、SEA數(shù)據(jù)庫檢索,獲得杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方活性成分作用靶點共計1 222個。

表1 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍藥物活性成分及其特性

2.2 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓潛在靶點 通過 OMIM、DrugBank及GeneCards 數(shù)據(jù)庫總共收集獲得高血壓相關(guān)靶點2 126個。使用在線數(shù)據(jù)庫Venny 2.1對高血壓相關(guān)靶點及杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方活性成分1 222個作用靶點取交集,共得到432個杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方治療高血壓的潛在靶點。詳見圖1。

圖1 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方活性成分治療高血壓潛在靶點的韋恩圖

2.3 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D 使用 Cytoscape構(gòu)建“藥物-成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,運用Network Analyzer對所得網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析,計算網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的度值,圖中橙色代表疾病靶點,粉色、紫色、綠色、藍(lán)色、橘色分別代表杜仲、澤瀉、懷牛膝、黃芪、地龍藥物及其有效成分,詳見圖2。網(wǎng)絡(luò)中藥物的同一活性成分可同時作用于多個靶點,而同一靶點可與多個藥物成分對應(yīng),提示杜仲、澤瀉、懷牛膝、黃芪、地龍組方對高血壓治療作用具有多成分、多靶點的協(xié)同特點。拓?fù)浣Y(jié)果顯示,“Degree”值較高的成分是槲皮素(quercetin,MOL000098)、山奈酚(kaempferol,MOL000422)、β-谷甾醇(β-sitosterol,MOL000358)、異鼠李素(isorhamnetin,MOL000354),為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分。

圖2 “杜仲、澤瀉、懷牛膝、黃芪、地龍藥物-成分-高血壓靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI構(gòu)建及核心基因 將共同的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,獲取PPI相關(guān)信息,利用Cytoscape軟件對PPI信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化(見圖3),圖中不同顏色及字體大小代表該靶點的作用強度,由深橙色至淺橙色、形狀由大到小表示Degree值由高至低,此外,選擇cytoHubba APP 對上述PPI網(wǎng)絡(luò)中密度較高的區(qū)域進(jìn)一步分析,篩選獲得排名前10位的關(guān)鍵靶點為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、類固醇受體輔助激活因子(SRC)、磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1(PIK3R1)、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶11(PTPN11)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α(PIK3CA)、表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、雌激素受體1(ESR1),并構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò),節(jié)點顏色默認(rèn)按度值由高至低(見圖4,紅色向黃色漸變),表明其可能是杜仲、澤瀉、懷牛膝、黃芪、地龍藥物組方治療高血壓的核心靶點。

圖3 杜仲、澤瀉、黃芪、懷牛膝、地龍組方活性成分治療高血壓靶點 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 杜仲、澤瀉、懷牛膝、黃芪、地龍藥物治療高血壓相關(guān)KEGG通路富集分析 對杜仲、澤瀉、懷牛膝、黃芪、地龍藥物組方治療高血壓432個共同靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析,設(shè)置篩選條件P<0.01獲得富集基因數(shù)量較多的代謝通路。在KEGG通路富集分析結(jié)果中包括190條重要通路,主要涉及癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、EGFR激酶抑制劑拮抗、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等,對前20條通路進(jìn)行可視化處理。詳見圖5。

圖5 KEGG功能富集分析氣泡圖

2.6 GO富集分析 通過R軟件對432個疾病-藥物共同靶點進(jìn)行分析,GO富集分析包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3部分。BP通路中交集基因主要與對含氧化合物反應(yīng)、外源性刺激、對有機物質(zhì)反應(yīng)等生物學(xué)過程有關(guān);CC主要與膜區(qū)、膜筏等有關(guān);MF主要富集于小信號傳遞、離子結(jié)合、催化活性、酶結(jié)合等細(xì)胞功能。根據(jù)Count排序,對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。詳見圖6。

圖6 GO富集分析結(jié)果

3 討 論

中醫(yī)因其“整體觀念”“辨證論治”的特點及多靶點、多通路的優(yōu)勢,越來越得到專家的認(rèn)可[9-10]。補腎和脈方在既往臨床研究的基礎(chǔ)上,以“腎氣虧虛,血脈自病”新病機和“補腎氣、和血脈”的新思路為基礎(chǔ),從高血壓損害的發(fā)病機制入手進(jìn)行組方,通過平補腎氣、調(diào)和血脈實現(xiàn)了標(biāo)本兼治、整體調(diào)節(jié)的高血壓治療策略[11]。方中的杜仲甘溫,可補腎陽、強筋骨,具有補益元氣、養(yǎng)血生血的黃芪可助真元,增加腎氣;甘緩性平的懷牛膝配伍澤瀉,具有利水滲濕、化痰降濁的功效;地龍可咸寒走下入腎,性善走竄,通行經(jīng)絡(luò)、清熱結(jié)通利水道,合澤瀉增強滲瀉濕濁之功。上述幾味中藥作為補腎和脈方的核心藥物,可共同發(fā)揮補腎益精、活血疏肝之功效。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討上述5味核心中藥治療高血壓的作用機制,篩選得到70種活性成分以及432個作用靶點,其中槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、異鼠李素等活性成分對應(yīng)的靶點較多。槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是一種低相對分子質(zhì)量多酚類植物化學(xué)物質(zhì),自然界中多以槲皮素糖苷的形式存在[12]。既往研究顯示,槲皮素可通過多途徑發(fā)揮降壓作用,也可通過抑制Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)通路改善大鼠高血壓,此外,槲皮素還可通過促血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬維持內(nèi)皮功能發(fā)揮降壓作用[13-14]。廣泛分布于各種水果、蔬菜中的黃酮類化合物山奈酚,被證實具有抗炎、抗氧化、心血管保護(hù)作用,大量報道已證實山奈酚的血壓調(diào)節(jié)作用,有研究顯示,山奈酚對血管舒張調(diào)節(jié)與一氧化氮(NO)-環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路有關(guān)[15]。山奈酚可通過抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)形成、降低巨噬細(xì)胞對ox-LDL攝取,從而預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生;此外,山奈酚還具有抗心肌細(xì)胞氧化和凋亡作用,該過程與其調(diào)控TLR4/NF-κB和蛋白激酶B(Akt)/叉頭盒O類轉(zhuǎn)錄因子-3a(FoxO3a)信號有關(guān)[16]。β-谷甾醇屬于四環(huán)三萜類化合物,作為一種化學(xué)結(jié)構(gòu)與哺乳動物膽固醇高度類似的植物類固醇,不僅可通過抗氧化和抗炎途徑發(fā)揮降壓作用,還能直接影響血管平滑肌功能,促進(jìn)血管擴張,降低外周血管阻力調(diào)節(jié)血壓[17]。

本研究通過 PPI 拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn),STAT3、SRC、PIK3R1、PTPN11、PIK3CA、EGFR、PTK2、MAPK3、VEGFA、ESR1等可能是補腎和脈方核心中藥治療高血壓的關(guān)鍵靶點。表皮細(xì)胞生長因子(EGF)及VEGFA均為生長因子,其中EGFR是一種受體型蛋白酪氨酸激酶,廣泛表達(dá)于包括心臟和血管的正常組織,是調(diào)控許多基本的細(xì)胞生物過程(如分化、增殖、遷移等)的重要因子,有研究證實,EGFR與繼發(fā)性高血壓誘發(fā)的心肌肥大和血管平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)[18]。VEGFA作為血管內(nèi)皮活性維持的重要調(diào)控因子,研究顯示,高血壓病變進(jìn)程可伴隨血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFA表達(dá)上調(diào),并證實過量的VEGFA可通過誘發(fā)局部微循環(huán)中的內(nèi)皮細(xì)胞過度分裂增殖,引起內(nèi)皮功能受損[19];STAT3、SRC、PIK3R1、PTPN11、PIK3CA、PTK2、MAPK3作為多種調(diào)控因子共用的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等多個生物學(xué)過程,既往研究證實其可通過影響氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥水平、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)等多種途徑參與高血壓病變進(jìn)程[20-22]。

在GO和KEGG分析中,補腎和脈方核心中藥治療高血壓的靶點功能主要有AGE-RAGE信號通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、EGFR激酶抑制劑拮抗、MAPK信號通路等。血管鈣化作為高血壓重要的病理基礎(chǔ)和危險因素之一,研究顯示,AGE-RAGE信號通路可通過調(diào)控自噬、上調(diào)ENPP1表達(dá)等途徑影響血管平滑肌細(xì)胞功能參與血管鈣化過程[23]。MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,存在著多條并行信號通路,包括p38-MAPK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK),目前MAPK信號通路改變對心血管疾病發(fā)生發(fā)展的影響作用已獲得普遍認(rèn)可。結(jié)合GO分析結(jié)果及拓?fù)涞暮诵陌悬c,推測補腎和脈方的核心中藥治療高血壓的潛在機制主要涉及抗炎、RAAS系統(tǒng)、鈣離子拮抗劑作用、舒張血管及改善內(nèi)皮功能等方面。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),對補腎和脈方中5味核心中藥治療高血壓的分子機制進(jìn)行了初步探討,明確了槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、異鼠李素等活性成分可能通過減少氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞損傷、減少細(xì)胞凋亡等途徑實現(xiàn)對高血壓的改善作用,揭示了補腎和脈方中5味核心中藥可通過多成分、多途徑、多靶點實現(xiàn)對高血壓的協(xié)同治療作用。