侍雯婧，田逸君，董雅春，吳文惠，張 添，張惠姝，朱玉平

(1．海軍軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系衛(wèi)生毒理學教研室，上海 200433；2．上海海洋大學食品學院海洋藥物與健康食品研究中心，上海 201306；3．海軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗教學中心，上海 200433)

正常生理情況下，血液循環(huán)的纖溶系統(tǒng)與凝固作用處于平衡狀態(tài)，當血流速度低會形成低剪切力的漩渦區(qū)，進而引發(fā)形成附壁血栓、血小板機能亢進、血管內(nèi)皮細胞受損等機體改變。這將打破纖溶與凝固的生理平衡，形成肺動脈血栓、心肌梗塞、腦栓塞及肢體動脈血栓等難治性心腦血管疾病[1]，探索高效和特異性溶栓藥物就成為治療這些難治性疾病的熱點之一。目前臨床應用有非特異性和特異性溶栓藥物兩類，纖維蛋白非特異性血栓溶解藥在溶解血栓的同時分解纖維蛋白原導致出血現(xiàn)象；纖維蛋白特異性溶栓藥物在血栓存在下纖溶活性顯著增加，但半衰期短[2]。兩類藥物均存在缺點或呈現(xiàn)不同程度的副作用，因此，開發(fā)溶栓藥效優(yōu)良和副作用小的新型溶栓藥物就成為現(xiàn)代治療血栓性心腦血管疾病的有效途徑之一。

許多研究提示小分子溶栓藥物不但具有優(yōu)良的溶栓藥效而且副作用更小[3]。從海洋微生物長孢葡萄穗霉菌FG216(Stachybotrys longisporaFG216)中發(fā)現(xiàn)的吡喃并異吲哚酮小分子溶栓先導化合物即真菌纖溶化合物1(fungi fibrinolytic compound 1，F(xiàn)GFC1)[4]具有明確的纖維蛋白原作用靶點，顯著不同于具有纖維蛋白和纖維蛋白原等多個靶點的生物大分子溶栓藥物尿激酶。FGFC1 可透過CACO-2 細胞單層膜的特性預示著可以口服給藥，與生物大分子溶栓藥物如重組人尿激酶原只能靜脈給藥比較具有明顯優(yōu)勢，另外基于海洋生物來源的FGFC1分子活躍基團可修飾獲得新型溶栓藥物[5]。小分子溶栓藥物FGFC1 對于研究纖溶酶原靶點溶栓原理具有重要意義，且作為海洋新藥在治療難治性心腦血管疾病方面具有應用價值[6]。

此前尚無研究對FGFC1 遺傳毒性進行系統(tǒng)的評估，在本研究中，我們通過回復突變試驗(Ames 試驗)、體外培養(yǎng)中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細胞微核試驗對FGFC1的遺傳毒性進行了研究，為FGFC1的臨床前毒性評價提供了資料[7]。

1 材料與方法

1.1 受試物及主要試劑

受試物FGFC1 化學結(jié)構(gòu)見圖1。玻璃瓶裝，規(guī)格為10 mL/支，純度為98%，淺黃色透明液體，避光冷藏，由上海海洋大學提供。

圖1 FGFC1的化學結(jié)構(gòu)式

Ames 試驗和體外培養(yǎng)CHO 細胞染色體畸變試驗中使用FGFC1溶液濃度為10 mg/mL，ICR小鼠骨髓細胞微核試驗中使用FGFC1 溶液濃度為5 mg/mL。溶劑對照為5%碳酸氫鈉溶液。大鼠肝微粒體酶S9 產(chǎn)自美國Moltix公司，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 菌株和細胞

組氨酸缺陷型鼠疫沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535，由復旦大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生教研室捐贈。實驗前對其進行鑒定(包括R因子、組氨酸缺陷型和自發(fā)逆變量等)，均符合規(guī)定標準。在(37±1) ℃和120 r/min 的搖動培養(yǎng)箱中孵育10 h，用于實驗。CHO 細胞由復旦大學公共衛(wèi)生學院毒理教研室捐贈。

1.3 動物

ICR 小鼠共60 只，每組10 只，雌雄各半，5～6 周齡， 體質(zhì)量21.0～24.2 g， 動物質(zhì)量合格證號2008001626070。

1.4 實驗方法

根據(jù)《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》[8-9]的設(shè)計要求，分別采用Ames 試驗[10]、體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗[11]和小鼠骨髓細胞微核試驗[12]測定FGFC1的遺傳毒性。檢測終點覆蓋基因突變、染色體畸變、細胞有絲分裂異常。

1.4.1 Ames 試驗 根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》的要求，TA97、TA98、TA100、TA102 及TA1535組氨酸缺陷型菌株由于FGFC1原液濃度限制，最高劑量設(shè)為1000 mg/皿，下面劑量依次為500、50、5、0.5 mg/皿，共5 個劑量組。此外，設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照組，各陽性對照品劑量見表1[13]。采用標準平板摻入法，使細菌在加和不加代謝活化系統(tǒng)(S9 混合液)的條件下接觸受試物(+S9 組在每個平皿的試驗體系中加入0.5 mL的S9混合液，-S9組在每個平皿的試驗體系中加入0.5 mL的PBS)。每皿均加入0.1 mL的不同濃度供試品溶液、溶劑對照溶液或陽性對照溶液，在各劑量組和對照組中設(shè)置了3 個平行皿。用最低限度瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，首先用顯微鏡觀察平皿上的菌苔，確定菌苔生長未受到FGFC1明顯的細菌抑制或殺菌作用，然后人工計數(shù)每個平皿的回復突變菌落數(shù)量，記錄并計算各組菌落數(shù)量的平均值和標準差，并與溶劑對照組比較。反復試驗1次[7]。

表1 Ames試驗中各陽性對照品的劑量設(shè)置

1.4.2 體外培養(yǎng)CHO 細胞染色體畸變試驗 在正式試驗前進行1次或多次預試驗以確定IC50濃度。本次實驗IC50濃度250.41 mg/mL，故設(shè)低、中和高劑量組終濃度為62.5、125和250 mg/mL，陽性對照組的絲裂霉素C 和環(huán)磷酰胺的最終濃度分別為0.5 和60 μg/mL，將其他溶劑對照組(碳酸氫鈉溶液)分別作為兩個平行樣品，反應體系為10 mL。+S9 組在每瓶的試驗體系中加入0.5 mL的S9混合液作用4 h后傾倒細胞培養(yǎng)瓶中的所有培養(yǎng)基，洗滌后再加入10 mL完全1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h；短時處理-S9 組培養(yǎng)4 h 后傾倒所有含有受試物的培養(yǎng)液體，然后再加入10 mL的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h；長時處理-S9 組不換液，細胞與受試物接觸24 h后收集細胞。在培養(yǎng)瓶中加入低、中、高劑量相應濃度FGFC1溶液、溶劑對照溶液或陽性對照溶液，使細胞暴露于測試化學物質(zhì)中直至收集細胞。收獲細胞前用秋水仙堿(最終濃度為0.2 μg/mL)處理4 h，消化細胞，經(jīng)離心后用低滲液(0.75%氯化鉀溶液)處理，進而固定液(V甲醇∶V冰醋酸＝3∶1)固定，最后將細胞滴在載玻片上，自然晾干，用Giemsa染色。每組制備2～3張玻片標本。

各組用顯微鏡觀察完整并且分散良好的中期分裂相細胞的染色體，觀察數(shù)量為200個細胞(陽性對照組分析至少100 個細胞)。記錄染色體或染色單體的斷裂、在缺損和其他類型的結(jié)構(gòu)異常情況下(裂紋和核內(nèi)復制一般不作為突變類型處理)，計算突變率[13]。

1.4.3 小鼠骨髓細胞微核試驗 小鼠檢疫期結(jié)束后分別按低、中、高組給藥，劑量分別為62.5、125.0、250.0 mg/kg，其中高劑量組設(shè)兩組分別在藥物作用24和48 h 后處死，同時設(shè)置了陽性對照組和溶劑對照組。取股骨骨髓制作骨髓涂片，每只動物制作2 張涂片，甲醇固定后用pH=6.8 的Giemsa 染色液染色。每只小鼠對約2000個骨髓嗜多染色紅細胞(PCE)進行鏡檢，計數(shù)含微核的PCE 數(shù)(MNPCE)，計算微核發(fā)生率，同時記錄200 個PCE 計數(shù)過程中觀察到的正染色紅細胞(NCE)的數(shù)量，計算PCE/NCE值[13]。

1.4.4 劑量設(shè)計 對于易溶性無毒化合物，細菌實驗的最高濃度應達到5 mg/皿[14]。由于受試物原液濃度限制，最高劑量只能達到1 mg/皿劑量，故本次Ames試驗中，設(shè)每皿0.5、5、50、500 和1000 μg 共5 個劑量組。每皿均加入相應濃度的供試品溶液0.1 mL，另設(shè)空白對照、溶劑對照和陽性對照。

在染色體畸變試驗中，毒性水平應高于50%細胞抑制率或細胞融合率[15]。通過預實驗確定供試品的IC50為250.41 mg/mL。故設(shè)染色體畸變試驗的低、中、高劑量組為62.5、125.0 和250.0 mg/mL，試驗時在10 mL 的試驗體系中分別加入0.1 mL 應用液，另設(shè)陽性對照組和溶劑對照組。

小鼠骨髓細胞微核試驗采用尾靜脈注射給藥，小鼠急性毒性結(jié)果的1/2 半數(shù)致死量(LD50)為最高用量。由于受試物原液濃度限制，LD50大于最大給藥劑量，故微核設(shè)總劑量分別為62.5、125.0、250.0 mg/kg(單次給藥量設(shè)定為31.25、62.5、125 mg/kg，分上、下午2次注射給藥)，給藥體積按25 mL/kg計算，同時設(shè)置陽性對照組和溶劑對照組。陽性對照組以40 mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺，給藥體積按10 mL/kg計算，溶劑對照組的給藥方法與受試組相同，按25 mL/kg計算給藥體積，尾靜脈注射碳酸氫鈉溶液。

1.5 統(tǒng)計方法

Ames試驗結(jié)果的評價以溶劑對照組的回復突變菌落數(shù)為基礎(chǔ)，各劑量組與之進行比較。某劑量組回復突變菌落數(shù)為溶劑對照組的2 倍以上呈現(xiàn)再現(xiàn)性，或在一定的劑量范圍內(nèi)存在劑量-反應關(guān)系，則判斷為陽性。體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細胞微核試驗的結(jié)果均采用卡方檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 Ames試驗結(jié)果

受試物各劑量組和對照組的平皿均可見背景菌苔生長。5 個菌株的自發(fā)回復突變菌落數(shù)以及陽性對照品誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)均在歷史參考范圍內(nèi)，并且各菌株陽性對照組的回復突變菌落與空白對照組相比數(shù)目顯著增加，提示本試驗系統(tǒng)符合要求[14，16]。在可做到的最高劑量1000 mg/皿的受試條件下，未觀察到受試物的抑菌現(xiàn)象。各劑量組受試物在加或不加S9時對TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 所誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)均與自發(fā)的突變菌落數(shù)相近，未觀察到明顯的劑量-反應關(guān)系。Ames 試驗計數(shù)的回復突變菌落數(shù)結(jié)果見表2和表3。

表2 FGFC1的Ames試驗結(jié)果(個/皿，x±s，第1次)

表3 FGFC1的Ames試驗結(jié)果(個/皿，x±s，第2次)

2.2 體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗結(jié)果

染色體分析結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，陽性對照組可誘發(fā)受試細胞染色體畸變率顯著增加(P＜0.05)，且畸變率均在歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，驗證了該系統(tǒng)的有效性[14，16]；FGFC1濃度為62.5、125和250 mg/mL各劑量組細胞染色體畸變率均小于5%，與溶劑對照組結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。體外培養(yǎng)CHO 細胞染色體畸變試驗計數(shù)結(jié)果見表4、表5 和表6。

表4 FGFC1的體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗結(jié)果(+S9，24 h)

表5 FGFC1的體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗結(jié)果(-S9，24 h)

表6 FGFC1的體外培養(yǎng)CHO細胞染色體畸變試驗結(jié)果(-S9，4 h)

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果

試驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析表明，陽性對照組雌性和雄性小鼠骨髓PCE微核發(fā)生率分別為14.58‰和14.05‰，與溶劑對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，驗證了本次試驗系統(tǒng)的有效性。FGFC1 在62.5、125.0、和250.0 mg/kg劑量未觀察到對小鼠骨髓細胞微核形成的抑制作用，小鼠骨髓PCE微核發(fā)生率與溶劑對照組相比差異均無統(tǒng)計意義(P＞0.05)。結(jié)果見表7。

表7 FGFC1的小鼠骨髓嗜多染色紅細胞微核試驗結(jié)果(n=5)

3 討論

FGFC1 是一種罕見的化合物，相對分子質(zhì)量為869，從海洋真菌FG216 中分離出來[4]。FGFC1是一種無出血性風險的溶栓劑，在體內(nèi)外均能降解纖維蛋白[14]。FGFC1 在Wistar 大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究表明，F(xiàn)GFC1在大部分組織中分布迅速，但在大腦中不分布。FGFC1(10 mg/mL)用于治療Wistar 大鼠時，可溶解大部分肺血栓[16]。在以前的研究中支持了化合物的纖溶活性降低出血風險的概念。具體來說，F(xiàn)GFC1促進了溶栓，而不誘導出血性活性。此外，F(xiàn)GFC1在體內(nèi)和體外均能有效促進FITC-纖維蛋白的降解，而未增加纖維蛋白(原)溶解的風險。FGFC1 是一種治療血栓形成的潛在藥物[15]。鮮有文獻報道FGFC1 的安全性研究，前期本GLP 實驗室的結(jié)果表明，ICR 小鼠的LD50＞250 mg/kg，兩次急性毒性的結(jié)果表明，F(xiàn)GFC1顯示低毒性。

本研究體外采用Ames 試驗平板摻入法和CHO 細胞染色體畸變試驗，體內(nèi)采用ICR 小鼠骨髓微核試驗，是研究遺傳毒性的經(jīng)典組合，能檢測基因突變、染色體形態(tài)變化和染色體分離變化等多個遺傳學終點，符合國際標準化要求[14-16]。每個實驗均按照GLP批準機構(gòu)的既定程序進行，以確保結(jié)果的可靠性。

此前未有文獻對FGFC1遺傳毒性方面的報道。本試驗條件下，從Ames 試驗、CHO 細胞體外染色體畸變試驗和小鼠骨髓微核試驗得到的結(jié)果表明，F(xiàn)GFC1無遺傳毒性和潛在致癌性，是一種非遺傳毒性藥物。本研究提高了人們對接觸FGFC1相關(guān)風險的認識，在FGFC1開發(fā)過程和治療的用藥風險中起著重要作用。