孟 琳，楊華宇，馬秀梅，2，

(1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050)

胰腺癌是目前全球第四大癌癥死亡原因，近年來，胰腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，約占腫瘤發(fā)病率的2%[1]。胰腺癌早期發(fā)病過程不具有特異性癥狀，缺乏早期診斷和治療方法，受關(guān)注度相對較低[2]。因此，探討胰腺癌發(fā)病原因，積極尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對于降低胰腺癌患者死亡率和延長患者壽命至關(guān)重要。

剪接因子2/選擇性剪接因子(splicing factor 2/alternative splicing factor，SF2/ASF)是一種高度保守的、由SRSF1基因編碼的、參與組成性剪接和選擇性剪接的RNA 結(jié)合蛋白，屬于SR 蛋白家族(serine/arginine-rich protein，SRp)[3]，被定義為癌蛋白，是第1 個被證實(shí)與腫瘤直接相關(guān)的剪接因子[4]。P53是一種抑癌基因，該基因的突變或缺失是導(dǎo)致許多腫瘤發(fā)生的原因，50%以上的惡性腫瘤都出現(xiàn)過P53突變[5]，是病理學(xué)中衡量腫瘤預(yù)后的指標(biāo)之一。Ki67是細(xì)胞增殖的核蛋白標(biāo)記物，可表達(dá)于除G0 期以外的處于其它細(xì)胞周期的增殖細(xì)胞中[6]，是判斷惡性腫瘤預(yù)后的可靠標(biāo)志物[7]。本實(shí)驗(yàn)通過采用生物信息學(xué)方法分析SRSF1基因在胰腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)差異，并使用免疫組織化學(xué)法檢測人胰腺癌組織中SF2/ASF、突變型P53 以及Ki67 蛋白的表達(dá)情況，探討SF2/ASF 與后兩者的相關(guān)性，分析其表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，為胰腺癌的早期診斷和治療方法的選擇提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

GEPIA 數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)是由北京大學(xué)團(tuán)隊研發(fā)，數(shù)據(jù)來源主要是TCGA 數(shù)據(jù)庫。在首頁輸入SRSF1，在Expression DIY 功能中選擇Profile，設(shè)定條件Dataste，選擇PAAD，|log2(FC)| Cut off 值設(shè)置為1.0，q-value Cut off 值設(shè)置為0.01，在Differential Methods 中選擇ANOVA，得出SRSF1基因在胰腺癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)的散點(diǎn)圖。在GEPIA數(shù)據(jù)庫首頁輸入SRSF1，在Expression DIY 功能中選擇Boxplot，設(shè)定條件Dataste Selection，選擇PAAD，|log2(FC)| Cut off 值設(shè)置為1.0，q-value Cut off 值設(shè)置為0.01，Jitter Size 值設(shè)置為0.4，Matched Normal data 中選擇Match TCGA normal and GTEx data，得出SRSF1基因在胰腺癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)的箱形圖。在GEPIA 數(shù)據(jù)庫首頁輸入SRSF1，在Correlation 功能中設(shè)定Gene1：SRSF1，Gene2：Tp53或MKi67(Ki67 的編碼基因)，在Correlation Coefficient選擇Pearson，在TCGA Tumor 中選擇PAAD Tumor，點(diǎn)擊PLOT，得出SRSF1基因與TP53和MKi67之間的相關(guān)性。

1.2 臨床資料

選取2016年1月—2020年12月從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理中心存檔的胰腺癌術(shù)后切除組織及其對應(yīng)的癌旁正常組織共60 例。男性患者30 例，女性患者30 例；年齡13～80 歲；組織病理分級(參考WHO 分級標(biāo)準(zhǔn))：高中分化44 例，低分化16 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46 例；遠(yuǎn)端臟器轉(zhuǎn)移24 例，無遠(yuǎn)端臟器轉(zhuǎn)移36例；TNM病理分期Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期34 例。選取其對應(yīng)的癌旁正常組織作為對照組。標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片。所有標(biāo)本經(jīng)病理檢查均明確診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。采用電話采訪的方式對入選患者進(jìn)行隨訪，隨訪開始時間為出院日期，隨訪結(jié)束時間為術(shù)后死亡時間或隨訪截止日期，即2022年9月1 日，隨訪時間范圍為1～48 個月，中位隨訪時間為38 個月?；颊咝g(shù)后第1 天至其最終死亡時間或到隨訪截止時間為總生存期(overall survival，OS)。本研究獲得患者知情同意和內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 主要試劑及儀器

SF2/ASF 抗體購自美國Santa Cruz 公司，P53 抗體、Ki67 抗體、免疫組化SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。顯微鏡購于江南永新，型號為BM2000。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定

1.4.1 免疫組化染色 將石蠟包埋的胰腺癌及癌旁正常組織切片浸入二甲苯中以去除石蠟，用乙醇梯度重新水化，滴加羊抗人單克隆抗體(1∶100 稀釋)，水浴鍋孵育60 min，PBS 沖洗后，滴加二抗，室溫下孵育10 min，PBS 再次沖洗后，滴加鏈霉素，室溫下孵育10 min，隨后滴加DAB工作液進(jìn)行復(fù)染，經(jīng)梯度脫水后光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4.2 結(jié)果判定 對染色結(jié)果進(jìn)行評分，評分過程由兩位病理科醫(yī)生各自獨(dú)立操作，采用兼顧陽性細(xì)胞染色的強(qiáng)度及數(shù)量作為判定標(biāo)準(zhǔn)。①按染色深淺計分：無染色為0 分，淡黃色染色為1 分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3 分；②按陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)計分：未見陽性表達(dá)細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤25%為1分，陽性細(xì)胞在(25%，50%]為2分，陽性細(xì)胞在(50%，75%]為3 分，陽性細(xì)胞＞75%為4 分。③按兩個結(jié)果評分相加作為最終判斷，0～3分為陰性，4～7分為陽性。P53和Ki67的免疫組化結(jié)果顯示陽性顆粒均定位于細(xì)胞核中，突變型P53 在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)是判斷腫瘤獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)；而Ki67 高表達(dá)則提示腫瘤細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，侵襲性高，是臨床上重要的判斷預(yù)后的因素。本實(shí)驗(yàn)只單純考慮陽性細(xì)胞核染色的數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)。P53 分級標(biāo)準(zhǔn)以陽性細(xì)胞數(shù)≤總數(shù)的5%為陰性，＞5%為陽性。Ki67 分級以增殖指數(shù)(proliferation index，PI)為標(biāo)準(zhǔn)，即計數(shù)10 個隨機(jī)高倍視野(×400)下1000 個腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，PI=陽性細(xì)胞總數(shù)/1000×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。胰腺癌組織及癌旁正常組織中SF2/ASF 高表達(dá)率的比較使用配對卡方檢驗(yàn)；SF2/ASF、突變型P53 和Ki67 之間的表達(dá)的相關(guān)性用Pearson 相關(guān)性分析；SF2/ASF的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系使用卡方檢驗(yàn)、連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析；采用Kaplan-Meier 法繪制患者生存曲線，生存曲線的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；預(yù)后分析采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SF2/ASF 在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中選擇匹配TCGA和GTEx數(shù)據(jù)共包含胰腺癌組織179 例，癌旁正常組織171 例，分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織中SRSF1基因的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P＜0.01，圖1)。

圖1 SRSF1基因在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平

2.2 胰腺癌組織中SF2/ASF 與P53 和Ki67 表達(dá)的相關(guān)性分析

在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中選擇匹配TCGA 數(shù)據(jù)，設(shè)置相關(guān)系數(shù)為Pearson，結(jié)果見圖2，可見在胰腺癌中SRSF1基因與TP53和MKi67的表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r分別為0.28和0.32，均為P＜0.01)。

圖2 SRSF1基因與TP53和Ki67的相關(guān)性

2.3 胰腺癌中SF2/ASF、突變型P53 和Ki67 蛋白的表達(dá)

免疫組化檢測結(jié)果見圖3 和表1，胰腺癌組織中SF2/ASF 和P53 蛋白的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。胰腺癌組織中Ki67增殖指數(shù)為(32.4±19.9)%，而癌旁正常組織中為0(P＜0.01)。

表1 胰腺癌和癌旁正常組織中SF2/ASF、突變型P53 蛋白的表達(dá)陽性率和Ki67增殖指數(shù)

圖3 SF2/ASF、突變型P53和Ki67蛋白在胰腺癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)情況(×400)

2.4 胰腺癌中SF2/ASF 與突變型P53 和Ki67 表達(dá)的相關(guān)性

卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果見表2，表明SF2/ASF 蛋白表達(dá)水平與突變型P53 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.386，P＜0.05)，與Ki67增殖指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.275，P＜0.05)。

表2 胰腺癌中SF2/ASF與突變型P53和Ki67表達(dá)的關(guān)系

2.5 SF2/ASF表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果見表3，可見SF2/ASF 高表達(dá)與胰腺癌分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有無遠(yuǎn)端臟器轉(zhuǎn)移有關(guān)(均為P＜0.01)，與胰腺癌發(fā)生部位和TNM 分期無明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。

表3 SF2/ASF表達(dá)與胰腺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.6 胰腺癌組織中SF2/ASF 的表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

在對60 例胰腺癌患者的隨訪過程中，根據(jù)SF2/ASF 蛋白的表達(dá)情況將所有患者分為SF2/ASF 高表達(dá)組(34 例)和SF2/ASF 低表達(dá)組(26 例)，繪制生存曲線，見圖4。

圖4 SF2/ASF蛋白表達(dá)與胰腺癌患者生存率的關(guān)系

2.7 SF2/ASF表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系

單因素Cox回歸分析結(jié)果見表4，可見SF2/ASF陽性表達(dá)(HR=0.264，P＜0.01)和年齡(HR=0.065，P＜0.01)可能是患者OS 的影響因素。多因素Cox 回歸分析表明，SF2/ASF 陽性表達(dá)(HR=0.336，P＜0.01)和年齡(HR=1.057，P＜0.01)是影響患者OS的獨(dú)立危險因素。

表4 Cox回歸分析胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素

3 討論

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤之一。它侵襲性高，隱匿性強(qiáng)，約80%的患者在就診時已處于局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]，5年生存率僅為15%～20%[9]。由于該腫瘤對射線、藥物不敏感等特點(diǎn)，導(dǎo)致常規(guī)的手術(shù)切除、放療、化療，乃至靶向藥物及免疫治療療效特異性均不高[10]，目前胰腺癌早期診斷和臨床治療的基礎(chǔ)理論與方法都不理想，患者預(yù)后極差。目前，針對胰腺癌早期診斷和臨床治療的措施較少，提高胰腺癌患者總體生存率是人類面臨的一個挑戰(zhàn)。

研究表明剪接因子在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)一種由SRSF1基因編碼的剪接因子SF2/ASF 能選擇性剪接致癌或抑癌因子，調(diào)節(jié)因子活性，從而加快腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為[11]。研究發(fā)現(xiàn)，SF2/ASF 在人結(jié)腸癌、小腸癌、腎癌、宮頸癌、肺癌和兒童白血病等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)[12-13]，但經(jīng)治療緩解后則其表達(dá)水平降低，提示其參與了這些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。SF2/ASF 在建立轉(zhuǎn)化表型、維持細(xì)胞生長、增殖和炎癥中發(fā)揮重要作用[3，14]，是一種潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。目前，SF2/ASF 在人類多種癌癥中異常表達(dá)[15]，但有關(guān)其在胰腺癌中的表達(dá)研究尚未見相關(guān)報道。P53 是一種抑癌基因，分為野生型和突變型兩類，在腫瘤生長過程中主要控制細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制和細(xì)胞不受控制的分裂[16]。既往文獻(xiàn)報道，約50%～60%的胰腺癌中存在突變型P53 的過度表達(dá)，其表達(dá)程度與患者預(yù)后有關(guān)[17-18]。Ki67 屬于核抗原，表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和生長密切相關(guān)[19]，研究表明，Ki67 在有絲分裂中起到了維持DNA結(jié)構(gòu)的作用，作為一種增殖標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于常規(guī)病理研究，是評估患者預(yù)后的指標(biāo)。P53和Ki67均參與調(diào)控胰腺癌生物學(xué)行為，并可作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測來評估胰腺癌的惡性程度及預(yù)后。

SF2/ASF 在腫瘤中表達(dá)及意義的相關(guān)性研究較少，為了進(jìn)一步探討SF2/ASF 在胰腺癌中的表達(dá)情況，本研究通過數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果顯示胰腺癌組織中SRSF1基因的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，SRSF1的表達(dá)與TP53和MKi67具有相關(guān)性；免疫組化法觀察SF2/ASF、突變型P53 和Ki67 蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。為了明確SF2/ASF、突變型P53 和Ki67 三者之間的相關(guān)性，經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)SF2/ASF 陽性表達(dá)與突變型P53 和Ki67 增殖指數(shù)均具有相關(guān)性，提示SF2/ASF 與突變型P53 蛋白在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能是相互協(xié)同作用，推測SF2/ASF 可能通過調(diào)節(jié)突變型P53 和Ki67 增殖指數(shù)而產(chǎn)生致癌作用。本研究卡方檢驗(yàn)分析SF2/ASF 和突變型P53 的相關(guān)性與生信分析結(jié)果不同，可能與此數(shù)據(jù)庫分析較為單薄，以及與本研究所選取的臨床數(shù)據(jù)較少有關(guān)，有待進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步研究。為了探討SF2/ASF 與胰腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，經(jīng)過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)胰腺癌高、中分化組中SF2/ASF 的表達(dá)明顯高于低分化組，淋巴轉(zhuǎn)移組和遠(yuǎn)端臟器轉(zhuǎn)移組中SF2/ASF 的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)移組，提示SF2/ASF 與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，可能對判斷患者的預(yù)后有一定的作用。通過Cox 回歸模型分析發(fā)現(xiàn)SF2/ASF高表達(dá)和患者年齡是影響胰腺癌患者OS 的獨(dú)立危險因素，提示SF2/ASF 也可能作為胰腺癌預(yù)后評估的新指標(biāo)。隨著年齡的增長，胰腺癌患者的OS 較短，推測可能與伴隨其他基礎(chǔ)疾病、營養(yǎng)不良、身體和認(rèn)知功能受損等原因有關(guān)。

綜上所述，SF2/ASF 在胰腺癌組織中高表達(dá)，有望作為臨床胰腺癌診斷和預(yù)后的一個新標(biāo)志物，并對評判腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)端臟器轉(zhuǎn)移具有重要意義，可能為胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的理論和思路，為胰腺癌治療提供新方案。但對于SF2/ASF 在胰腺癌中作用的認(rèn)識仍較局限，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的探索。