王 平，王華勇，王 浩，雷大軍，

(1．棗陽市第一人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，湖北棗陽 441200；2．棗陽市第一人民醫(yī)院骨科，湖北 棗陽 441200)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其發(fā)病高峰與青少年的青春期生長高峰相一致[1]。骨肉瘤通常發(fā)生在長骨干骺端的生長板附近，約三分之二的骨肉瘤發(fā)生在股骨遠端的膝關(guān)節(jié)周圍，其次是脛骨近端，再次為肱骨近端。盡管臨床治療手段不斷發(fā)展，但復發(fā)轉(zhuǎn)移患者的5年生存率仍不足20%[2]。骨肉瘤早期癥狀隱匿，臨床亟須高效靈敏的標志物，以實現(xiàn)骨肉瘤早期診斷和預后風險判斷。外泌體是一種大小30～100 nm 的微小脂質(zhì)囊泡，其內(nèi)包裹有核酸(包括miRNA)、蛋白質(zhì)和脂類等，可通過胞吐作用進入細胞微環(huán)境，調(diào)控多種生物過程[3]。外泌體miRNA 參與腫瘤微環(huán)境重建，在骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。外泌體miRNA 廣泛存在于血液、尿液等體液中，可通過非侵入性操作獲取，是骨肉瘤診斷和預后預測的重要方法。研究顯示，miR-193a和miR-21-5p 在促進骨肉瘤增殖轉(zhuǎn)移和化療耐藥中發(fā)揮重要作用[6-8]。本研究通過對112 例骨肉瘤患者和100例健康體檢者血清外泌體miR-193a 和miR-21-5p 表達水平進行檢測，擬探討血清外泌體miR-193a 和miR-21-5p在骨肉瘤診斷和預后預測中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2021年12月于棗陽市第一人民醫(yī)院骨科就診的骨肉瘤患者112 例為骨肉瘤組。納入標準：①病理確診為骨肉瘤；②抽血檢查前未接受手術(shù)或者放化療；③無合并其他系統(tǒng)疾??；④臨床病例資料完整。排除標準：①合并代謝性骨病或其他骨組織疾?。虎诎橛衅渌鞴俟δ苷系K；③病例失訪。同期選取該院體檢中心，100 例年齡性別匹配的健康體檢者作為健康組，對兩組人群進行血清外泌體檢測，并收集骨肉瘤組患者的年齡、性別、腫瘤直徑和TNM分期等臨床資料。本研究112例骨肉瘤患者中18周歲以下患者78 例，發(fā)病部位為股骨遠端患者68 例，腫瘤直徑＜8 cm[9]的患者84 例，病理類型為普通型78例，組織學分類為G1 級別者82 例。本研究經(jīng)棗陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會審批同意(批準文號為20170312)。

1.2 血清外泌體分離與鑒定

取受試者外周血5 mL，分離血清。利用外泌體提取試劑盒(廣州銳博生物公司)進行外泌體提取，將富集純化后的外泌體4 ℃保存。將分離提純的血清外泌體進行醋酸雙氧鈾水染色，利用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，并進一步利用Western blot 檢測外泌體特異性標志蛋白CD9 和CD63 的表達，保證分離提純外泌體的可靠性。CD9 和CD63 的抗體，均購自英國Abcam公司。Western blot具體操作步驟：①使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離提純的外泌體蛋白質(zhì)；②將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；③進行一抗CD9(1∶1000)和CD63(1∶1500)抗體孵育，內(nèi)參對照蛋白為GAPDH；④進行二抗孵育；⑤目標蛋白條帶發(fā)光顯示。

1.3 血清外泌體中miRNA提取與qPCR檢測

外泌體miRNA 提取試劑盒(DP501)購自德國Qiagen公司，按照試劑盒說明書進行外泌體miRNA提取，利用反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒(RR037Q，日本TaKaRa公司)將總miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Green Mix(日本TaKaRa)和C1000系統(tǒng)(美國Bio-Rad)進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測。選擇50 μL 擴增體系(上下游引物各2 μL，DNA 聚合酶2.5 U，10×緩沖液和dNTPs 4 μL，ddH2O 補齊至50 μL)，每個樣本重復檢測3 次，結(jié)果取平均值。用U6 作為miRNA 定量檢測的內(nèi)參[10]，采用2-ΔΔCT計算miR-193a 和miR-21-5p 的相對表達量。miR-193a、miR-21-5p 和U6 的引物序列設(shè)計、合成由擎科公司完成，序列(5′-3′)如下：miR-193a，F(xiàn)-TTCAACAACGTCCACCAA，R-CCAGACTCCGGTGT AGAC；miR-21-5p，F(xiàn)-AACTGCAGGCACTCGTTC，RTGCTGGAAGAGGTCGGTA；U6，F(xiàn)-AGCATTACTAAA ATTGAACAT，R-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計分析，采用GrapPad Prism 8 繪制圖形。計量資料采用xˉ±s表示，采用Wilcoxon 秩和檢驗進行兩組間比較；計數(shù)資料采用卡方檢驗進行兩組間比較。利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)下面積(area under curve，AUC)評估診斷效能。以約登指數(shù)取最大時，對應的指標值定義為截斷值，并計算該指標診斷的靈敏度和特異度。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體鑒定

分離提純的血清外泌體在透射電鏡下可見囊狀脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑約為100 nm(圖1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示CD9和CD63在血清提純的外泌體中高表達(圖1B)。

2.2 血清外泌體中miR-193a 和miR-21-5p 表達水平的分析

血清外泌體中miR-193a 和miR-21-5p 表達水平的分析結(jié)果見圖2，顯示骨肉瘤組血清外泌體中miR-193a和miR-21-5p表達水平均顯著高于健康對照組(P＜0.01)。

圖2 血清外泌體中miR-193a和miR-21-5p表達水平的差異分析

2.3 血清外泌體中miR-193a 和miR-21-5p 對骨肉瘤診斷價值的分析

分別以血清外泌體中miR-193a 和miR-21-5p 的表達量及兩者聯(lián)合預測值，進行骨肉瘤診斷，通過ROC曲線和AUC值進行診斷效能評估。結(jié)果見表1和圖3，miR-193a 和miR-21-5p 聯(lián)合診斷骨肉瘤的AUC為0.901，高于單一指標診斷效能。

表1 血清外泌體miRNA診斷骨肉瘤效能分析

圖3 miR-193a、miR-21-5p及二者聯(lián)合診斷骨肉瘤的ROC曲線

2.4 血清外泌體miR-193a 和miR-21-5p 表達水平與臨床特征的相關(guān)性分析

骨肉瘤血清外泌體中miR-193a 和miR-21-5p 表達水平，與骨肉瘤患者的年齡、性別和發(fā)病部位無明顯相關(guān)(均P＞0.05)，與腫瘤直徑、組織學分級、Enneking分期、遠處轉(zhuǎn)移和是否手術(shù)治療明顯相關(guān)(均為P＜0.05，見表2)，提示miR-193a和miR-21-5p可能與骨肉瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

表2 血清外泌體miR-193a 和miR-21-5p 表達水平與臨床病理指標分析

2.5 骨肉瘤患者不同臨床特征和血清外泌體中miR-193a、miR-21-5p表達水平的預后分析

為探索不同臨床特征和血清外泌體中miR-193a、miR-21-5p 表達對患者預后的影響，我們進行了單因素Cox分析，結(jié)果見表3，顯示腫瘤直徑＞8 cm，組織學分級G2、Enneking 分期IIB～III 期、伴有遠處轉(zhuǎn)移、未進行手術(shù)治療，以及血清外泌體中miR-193a、miR-21-5p 高表達是患者預后的危險因素(均為P＜0.05)；而患者年齡、性別和腫瘤部位對預后無顯著影響(均為P＞0.05)。

表3 不同臨床變量和血清外泌體miR-193a、miR-21-5p關(guān)系的單因素Cox分析

進一步利用Kaplan-Meier 生存曲線，分析血清外泌體中miR-193a 和miR-21-5p 表達水平對骨肉瘤患者預后的影響。結(jié)果見圖4，顯示miR-193a 和miR-21-5p 高表達組的骨肉瘤患者，總體生存率顯著低于低表達組患者(均為P＜0.05)。此結(jié)果提示miR-193a 和miR-21-5p可預測骨肉瘤患者預后。

圖4 血清外泌體miR-193a和miR-21-5p與骨肉瘤患者預后生存分析

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度高、侵襲性較強的原發(fā)性骨惡性腫瘤。盡管臨床診斷和治療手段不斷進步，仍有約1/5的患者就診時即伴有遠處轉(zhuǎn)移[2]，臨床亟須高效的診斷和預后預測標志物。血清外泌體及其內(nèi)包裹的miRNA，可調(diào)控腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移[5]。檢測外泌體中特定miRNA 的表達水平，可輔助骨肉瘤鑒別診斷和預測患者預后。

研究表明，miRNA在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤發(fā)生和進展中起著重要作用[11-12]。miR-21-5p 位于人類染色體的17q23.2，具有原癌基因特性[13]。miR-21-5p 可通過與靶基因的相互作用，調(diào)控腫瘤細胞增殖[12]。在骨肉瘤中，miR-21-5p 表達上調(diào)，與臨床病理指標密切相關(guān)，可作為骨肉瘤患者預后不良的生物標志物[14-15]。miR-193a 在食管癌、胃癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中表達上調(diào)[16-18]。研究顯示，miR-193a 表達與膀胱癌的多藥耐藥性相關(guān)[19]。在骨肉瘤中，Jacques 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-193a 通過抑制TAp73β，增加順鉑耐藥，miR-193a 表達促進骨肉瘤細胞系的遷移和侵襲。miR-193a-5p 在骨肉瘤組織中顯著上調(diào)，可促進骨肉瘤細胞(SaOS2 和U2OS)的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及小鼠異種移植物模型中的轉(zhuǎn)移[8]。外泌體來源的miRNA對腫瘤微環(huán)境形成具有重要作用，骨肉瘤中外泌體來源的miR-21-5p高表達，促進腫瘤抑制性微環(huán)境形成[21]。人骨髓間充質(zhì)干細胞中外泌體來源的miR-21-5p 可通過抑制骨肉瘤細胞中PIK3R1 的表達，激活PI3K/Akt/mTOR 通路，進而增強骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[7]。本研究中骨肉瘤患者血清外泌體miR-21-5p 和miR-193a 表達水平顯著高于健康對照組，且與高的轉(zhuǎn)移風險和更差的預后相關(guān)。此外，血清外泌體miR-2-5p 在骨肉瘤診斷方面同樣具有較好的診斷效能、靈敏度和特異度。血清外泌體miR-193a和miR-21-5p 兩者聯(lián)合，可顯著提高骨肉瘤診斷效能，AUC 值達0.901，具有較高的診斷準確度。此結(jié)果提示miR-193a 和miR-21-5p 表達對骨肉瘤診斷和臨床預后預測具有重要價值，但仍需要大樣本、多中心、前瞻性臨床隊列進行驗證。此外，血清外泌體miR-193a和miR-21-5p表達，對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的具體分子機制，仍需要進一步在細胞及動物實驗上進行研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清外泌體miR-193a 和miR-21-5p 表達水平顯著高于健康對照組，且miR-193a 和miR-21-5p 表達高的患者往往伴有更晚的TNM 分期、遠處器官轉(zhuǎn)移風險和更差的預后。血清外泌體miR-193a 和miR-21-5p 有望成為骨肉瘤診斷和預后預測的生物標志物。