史建紅，陳丁雄，盧曉童，郝佳潔，蔡 巖，王明榮，張 鈺

(國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

食管癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2016年食管癌的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別位居我國(guó)惡性腫瘤的第6 位和第4 位[1]。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國(guó)食管癌的主要病理類型，其預(yù)后差，死亡率高，多年來(lái)中晚期患者術(shù)后的5年生存率一直徘徊在15%～25%[2]。目前臨床上尚缺乏可高效治療ESCC 的藥物，因此迫切需要尋找新的有效藥物。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞的自我更新等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。既往研究表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常激活與ESCC、肝癌和結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[4-7]，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路是相關(guān)惡性腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。ICG-001 是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的一種小分子抑制劑，主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CREB 結(jié)合蛋白(creb-binding protein，CBP)從而干擾CBP 與β-catenin 的相互作用，由此抑制β-catenin/TCF 對(duì)下游靶分子的轉(zhuǎn)錄活化[8]。目前，已有多項(xiàng)研究證實(shí)ICG-001 可顯著抑制結(jié)直腸癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、唾液腺腫瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病等多種惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)、外的增殖能力[8-11]。然而，ICG-001 在ESCC 中的作用目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)分析了ICG-001 對(duì)ESCC 兩種細(xì)胞系KYSE410和KYSE450細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡及周期分布的影響，并通過(guò)檢測(cè)相關(guān)分子的mRNA 和蛋白表達(dá)水平的變化探討其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640 為Cell Technology 公司產(chǎn)品。胎牛血清購(gòu)自Newzerum公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自美侖生物公司。Opti-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司。CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司。細(xì)胞RNA提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司。TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。HiFiScript cDNA 合成試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。SKP2、Survivin和TCF4抗體購(gòu)自CST 公司，GAPDH 抗體購(gòu)自Proteintech 公司。DMSO購(gòu)自Sigma 公司。抑制劑ICG-001 購(gòu)自Selleck 公司。電泳儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)儀購(gòu)自Applied Biosystems 公司。濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Tanon 公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio Tek Instrument公司。化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410 和KYSE450購(gòu)自南京科佰生物公司，均使用添加10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 在96孔板中每孔接種3000個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每組設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，分別用25、50和100 μmol/L的ICG-001處理細(xì)胞24 和48 h 后使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，獲得D(450)值，以DMSO 處理細(xì)胞作為對(duì)照組，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.3 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 在6 孔板中每孔接種1000個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并分別用50和100 μmol/L的ICG-001處理KYSE410和KYSE450細(xì)胞進(jìn)行平板集落形成實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，甲醇固定后用0.5%結(jié)晶紫染液染色并計(jì)數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 分別使用50 和100 μmol/L 抑制劑ICG-001 處理KYSE410 和KYSE450 細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞沉淀，用70%乙醇固定過(guò)夜，用含RNA酶的PI染色，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并用Modifit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以DMSO處理細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞分組同1.2.4。使用抑制劑ICG-001處理48 h后收集細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，用Flowjo.10軟件作圖。

1.2.6 qPCR 檢測(cè) 細(xì)胞分組同1.2.4。ICG-001 處理24 h 后收集細(xì)胞，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用HiFiScript cDNA 合成試劑盒合成cDNA。使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒及ABI Quant-Studio 5 PCR儀進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。qPCR 20 μL擴(kuò)增體系為：cDNA 模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX 染料II 0.4 μL，2×TB Green 10 μL，RNase-Free 水6.8 μL。qPCR 反應(yīng)程序：95 ℃、30 s；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，40 個(gè)循環(huán)；60 ℃、1 min→95 ℃、15 s。以GAPDH基因mRNA 表達(dá)水平為參照對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)后由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列(5′-3′)如下：Survivin，F(xiàn)-GCCCAG TGTTTCTTCTGCTT，R-TCCGCAGTTTCCTCAAATTC；SKP2，F(xiàn)-ATGCCCCAATCTTGTCCATCT ，R-CACCGA CTGAGTGATAGGTGT；GAPDH，F(xiàn)-ACCCACTCCTCCA CCTTTGA，R-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA。

1.2.7 蛋白提取和Western blot 檢測(cè) ICG-001 處理24 h后收集細(xì)胞，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h 后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。一抗包括：β-catenin、SKP2、Survivin、TCF4 和GAPDH，使用5%脫脂牛奶按1∶1000 進(jìn)行稀釋。使用洗滌緩沖液TBST洗滌3次，每次8 min，加入對(duì)應(yīng)種屬的二抗(5%脫脂牛奶按1∶5000 進(jìn)行稀釋)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次8 min，配制ECL 發(fā)光液，使用Amersham Imager 800成像儀進(jìn)行曝光，以GAPDH 作為內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS Statistics 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行圖片制作。用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行多樣本均數(shù)的比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ICG-001抑制ESCC細(xì)胞的增殖活力

CCK-8 細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICG-001 處理24或48 h可抑制ESCC細(xì)胞系KYSE410和KYSE450的增殖活力，并呈劑量依賴性(P＜0.01，圖1)。

圖1 ICG-001處理24或48 h對(duì)ESCC細(xì)胞增殖活力的影響

2.2 ICG-001抑制ESCC細(xì)胞的集落形成能力

平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50和100 μmol/L的ICG-001 處理48 h 可顯著抑制ESCC 細(xì)胞系KYSE410和KYSE450的集落形成能力(P＜0.01，圖2)。

圖2 ICG-001處理48 h對(duì)ESCC細(xì)胞集落形成能力的影響

2.3 ICG-001誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，KYSE410和KYSE450細(xì)胞經(jīng)ICG-001 處理24 h 后，G0/G1 期細(xì)胞比例顯著增加，S 期和G2/M 期細(xì)胞比例相對(duì)降低(圖3)，提示ICG-001 可誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞發(fā)生G0/G1 期阻滯(P＜0.01)。同時(shí)，我們也檢測(cè)了ICG-001 處理細(xì)胞的凋亡情況，但未見(jiàn)到ESCC 細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡(結(jié)果未展示)。

圖3 ICG-001處理24 h對(duì)ESCC細(xì)胞周期分布的影響

2.4 ICG-001對(duì)β-catenin通路相關(guān)分子表達(dá)的影響

qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在ICG-001 處理的ESCC 細(xì)胞中，β-catenin/TCF 下游靶分子SKP2 和Survivin 的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.01)，而且可與β-catenin 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子TCF4 的mRNA 表達(dá)水平也明顯降低(P＜0.01，圖4)。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，SKP2、Survivin和TCF4的蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P＜0.01，圖5)。

圖4 ICG-001對(duì)β-catenin通路下游分子mRNA表達(dá)水平的影響

圖5 ICG-001對(duì)β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

ICG-001 可以有效抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。但迄今為止，ICG-001在ESCC中的作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，ICG-001 處理可顯著抑制ESCC 細(xì)胞的增殖能力。這與以往研究在結(jié)腸癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、胃癌、葡萄膜黑色素瘤和鼻咽癌細(xì)胞中所觀察到的現(xiàn)象一致[8-9，12-14]。我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ICG-001可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，但并未見(jiàn)到明顯的細(xì)胞凋亡。與本文結(jié)果相似的是，Michael等[8-9，12]在胰腺導(dǎo)管腺癌、結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞中的研究結(jié)果也顯示ICG-001 可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1 期阻滯。同時(shí)，在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中ICG-001 也是主要通過(guò)誘導(dǎo)G0/G1 期阻滯抑制細(xì)胞增殖，但對(duì)細(xì)胞存活無(wú)明顯影響[9]。而在結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞中，ICG-001不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)也誘發(fā)了明顯的細(xì)胞凋亡[8，12]。

既往文獻(xiàn)報(bào)道ICG-001可以抑制β-catenin 的轉(zhuǎn)錄活性[8]，為進(jìn)一步探討ESCC 細(xì)胞中ICG-001作用的分子機(jī)制，我們檢測(cè)分析了ICG-001 處理細(xì)胞后β-catenin 通路相關(guān)分子的表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)β-catenin信號(hào)通路下游分子SKP2和Survivin的表達(dá)明顯下調(diào)。以往有多項(xiàng)研究顯示抑制SKP2 表達(dá)可導(dǎo)致G0/G1期阻滯[15-16]，本研究結(jié)果亦提示ICG-001可能通過(guò)下調(diào)SKP2 的表達(dá)將ESCC 細(xì)胞阻滯在G0/G1 期，但其作用的詳細(xì)機(jī)制還有待深入研究。另一方面，有研究顯示ICG-001 可通過(guò)下調(diào)Survivin 誘導(dǎo)結(jié)腸癌和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[8，17-19]。但是，在本研究和另一項(xiàng)關(guān)于胰腺導(dǎo)管腺癌的研究中，雖然ICG-001 處理下調(diào)了Survivin 的表達(dá)水平，但細(xì)胞并未發(fā)生明顯凋亡[9]。我們推測(cè)這兩類細(xì)胞中可能存在某些負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但相關(guān)分子機(jī)制目前尚不清楚。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，β-catenin 可與TCF4 結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物激活SKP2和Survivin等靶基因的轉(zhuǎn)錄[9，20-21]。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)ICG-001處理可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子TCF4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。因此，我們推測(cè)ICG-001 除了干擾β-catenin 和CBP 結(jié)合，還可能通過(guò)下調(diào)TCF4 的表達(dá)進(jìn)而抑制β-catenin/TCF 復(fù)合物的功能，導(dǎo)致SKP2和Survivin的表達(dá)水平降低。目前，ICG-001對(duì)TCF4表達(dá)的影響尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道，相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，ICG-001 可顯著抑制ESCC 細(xì)胞的增殖潛能，提示ICG-001 可通過(guò)影響β-catenin/TCF 復(fù)合物的功能從而抑制下游靶分子Survivin 和SKP2 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1 期阻滯進(jìn)而抑制ESCC 細(xì)胞的增殖。目前臨床上缺乏療效顯著的ESCC 治療藥物，亟須研發(fā)有效的治療藥物和治療方案。本研究結(jié)果提示ICG-001 是潛在的ESCC 治療藥物，將其單獨(dú)或聯(lián)合其他治療手段有可能提高臨床療效。后續(xù)研究將進(jìn)一步檢測(cè)ICG-001 對(duì)ESCC 細(xì)胞移植瘤增殖的抑制作用，在體內(nèi)模型中驗(yàn)證其治療潛力，以期為ESCC 的治療提供新的候選藥物及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。