劉 穎，王 蕊，郭 曉，董律吏，張 艷，趙銀環(huán)，杜 蕓

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心，河北石家莊 050011)

肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-2]，肺腺癌是肺癌中最常見(jiàn)的病理類型。晚期肺腺癌患者往往具有胸腔積液轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，染色體越不穩(wěn)定，DNA倍體異常細(xì)胞越多。應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助DNA 倍體分析可以測(cè)定腫瘤細(xì)胞核的DNA 含量，計(jì)數(shù)胸腔積液中DNA倍體異常細(xì)胞。肺腺癌中最常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因突變是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，在亞洲人中EGFR突變率為40%～62%[2]。EGFR突變狀態(tài)與肺腺癌生物學(xué)行為及預(yù)后相關(guān)，然而研究結(jié)果并不一致。DNA倍體異常通常用于輔助細(xì)胞病理學(xué)的診斷，已有研究表明DNA 倍體異?？赡苡绊懛蜗侔┗颊叩念A(yù)后[3]，DNA 倍體異常與腫瘤增殖密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞增殖一般伴有染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常[4]，但對(duì)于DNA 倍體異常與EGFR突變之間的關(guān)系卻少見(jiàn)報(bào)道。本研究將肺腺癌患者胸腔積液中的肺腺癌細(xì)胞用于DNA倍體分析和基因檢測(cè)，分析癌細(xì)胞的DNA 倍體異常和EGFR突變之間的關(guān)系，并探究其對(duì)患者預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 病例收集

本研究采用回顧性分析來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2012年1月—2019年12月期間439例肺腺癌患者的臨床資料?；颊叩娜脒x標(biāo)準(zhǔn)包括：①經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)診斷及免疫細(xì)胞化學(xué)確診為胸腔積液肺腺癌轉(zhuǎn)移；②單發(fā)肺癌；③有明確的DNA 倍體分析及EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果。所有患者均隨訪至死亡或研究截止日期(2019年12月31 日)，統(tǒng)計(jì)患者的總生存期(overall survival，OS)，即確診肺腺癌至患者出現(xiàn)死亡或本研究截止日期。本研究經(jīng)過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)2019MEC102)，且臨床資料收集均已獲得患者知情同意書(shū)。吸煙史定義為入院前平均每天吸煙≥1支，且持續(xù)時(shí)間超過(guò)6個(gè)月。

1.2 胸水的處理

用一次性細(xì)胞采集器富集胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞，制作涂片，進(jìn)行HE 染色。并采用免疫細(xì)胞化學(xué)法[5]，選擇NapsinA、TTF1、P40、P63、Syn、CD56、CEA、WT1等抗體診斷肺腺癌胸腔積液轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)所有抗體均為即用型抗體，均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 計(jì)算機(jī)輔助DNA倍體分析

制作胸腔積液涂片進(jìn)行Feulgen 染色，使用購(gòu)自武漢蘭丁的計(jì)算機(jī)輔助DNA圖像定量分析系統(tǒng)(DNAICM)檢測(cè)染色細(xì)胞核的集成光密度(integrated optical density，IOD)來(lái)測(cè)定細(xì)胞核DNA 含量，用DNA 指數(shù)(DNA index，DI)來(lái)表示DNA含量[6]。DI為腫瘤細(xì)胞核DNA均值與正常細(xì)胞DNA均值的比值，它反映了腫瘤細(xì)胞總DNA含量的相對(duì)水平。DI計(jì)算公式如下：

正常細(xì)胞的DI 是2c(1c 為正常G0/G1 組DNA 含量的一半，因此G0/G1 細(xì)胞為2c 細(xì)胞，即二倍體細(xì)胞)。大于5c 細(xì)胞(5 倍體細(xì)胞)被判斷為DNA 倍體異常細(xì)胞。計(jì)算大于5c 細(xì)胞的百分比，即DNA 含量大于5c的細(xì)胞數(shù)量/DNA 含量大于2c 的細(xì)胞數(shù)量×100%；大于9c 細(xì)胞的數(shù)目，即前20 個(gè)細(xì)胞中大于9c 的細(xì)胞數(shù)；大于5c 細(xì)胞的平均DI 值，即前20 個(gè)細(xì)胞中大于5c細(xì)胞的平均DI值。

非整倍體細(xì)胞峰為在2c以后可出現(xiàn)大量非整倍體細(xì)胞，并形成峰，根據(jù)形成峰的多少可分為無(wú)峰、單峰、雙峰和多峰。

1.4 EGFR突變檢測(cè)

利用人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(廈門(mén)艾德公司)，通過(guò)ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermofisher公司)，采用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)-PCR 技術(shù)(amplification refractory mutation system，ARMS)對(duì)從胸腔積液腫瘤細(xì)胞中提取的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)EGFR基因突變類型。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、5 min；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s，15 個(gè)循環(huán)；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s，36個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)比較分類變量組間分布差異，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用秩和檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和Kendall's taub系數(shù)評(píng)價(jià)DNA 倍體異常與EGFR突變的相關(guān)性，單因素生存分析用Kaplan-Meier 法及Log-rank 檢驗(yàn)，多因素生存分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。用R語(yǔ)言的最優(yōu)截?cái)嗨惴▉?lái)確定連續(xù)參數(shù)的截?cái)嘀?，選擇在生存分析中意義最大的截?cái)嘀底鳛樽顑?yōu)截?cái)嘀怠?/p>

2 結(jié) 果

2.1 EGFR基因突變與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

439例肺腺癌患者中，共有244例(55.58%)檢測(cè)出EGFR突變。其中外顯子19缺失100例(40.98%)，外顯子21突變113例(46.31%)，其他突變31例(12.7%)。如表1所示，EGFR突變與患者年齡無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。男性、有吸煙史、大于5c 細(xì)胞的百分比＜14%、大于9c細(xì)胞的數(shù)目＜8、最大DI 值＜6、大于5c 細(xì)胞的平均DI值＜5的患者，其EGFR基因突變率降低(P＜0.05)。非整倍體細(xì)胞峰的不同分組間EGFR突變率不同(P＜0.01)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)單峰和雙峰EGFR突變率高于無(wú)峰患者，而多峰患者與其他各峰間EGFR突變率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 EGFR基因突變與肺腺癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

2.2 DNA倍體異常與EGFR基因突變的相關(guān)性

如表2 所示，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR突變患者大于5c細(xì)胞的百分比、大于9c細(xì)胞的數(shù)目、最大DI 值、大于5c 細(xì)胞的平均DI 值、非整倍體細(xì)胞峰數(shù)的平均秩次高于EGFR野生型患者(P＜0.01)。Kruskal-WallisH檢驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR各突變組間大于5c 細(xì)胞的百分比、最大DI 值、大于5c 細(xì)胞的平均DI值、非整倍體細(xì)胞峰數(shù)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而EGFR不同突變組大于9c細(xì)胞的數(shù)目經(jīng)Bonferrni 法校正后兩兩分析比較發(fā)現(xiàn)，21號(hào)外顯子突變的大于9c 細(xì)胞的數(shù)目的平均秩次高于其他突變組(P=0.049)。采用Kendall's tau-b相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)DNA 倍體異常和EGFR突變的關(guān)系，大于5c 細(xì)胞的百分比、大于9c 細(xì)胞的數(shù)目、最大DI 值、大于5c 細(xì)胞的平均DI 值、非整倍體細(xì)胞峰數(shù)均和EGFR突變均存在較弱的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，Kendall's tau-b分別為0.186、0.153、0.110、0.156、0.148，說(shuō)明EGFR突變率隨DNA倍體異常比例增加而升高。

表2 DNA倍體異常與EGFR基因突變的相關(guān)性(平均秩次)

2.3 DNA 倍體異常與EGFR 突變對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響

本實(shí)驗(yàn)采用OS 作為主要結(jié)局指標(biāo)。如表3 所示，單因素生存分析結(jié)果顯示，≤62 歲、女性、不吸煙的患者預(yù)后好于大于62歲、男性、吸煙的患者；大于5c細(xì)胞的百分比≥14%、大于9c細(xì)胞的數(shù)目≥8的患者預(yù)后好于大于5c 細(xì)胞的百分比＜14%、大于9c 細(xì)胞的數(shù)目＜8的患者；EGFR突變型患者的預(yù)后較EGFR野生型患者更好。而多因素生存分析結(jié)果顯示，大于5c細(xì)胞的百分比(P=0.171)、大于9c細(xì)胞的數(shù)目(P=0.176)及性別(P=0.799)與晚期肺腺癌患者預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系；EGFR突變是患者的正向獨(dú)立預(yù)后影響因素，年齡、吸煙是患者的負(fù)向獨(dú)立預(yù)后影響因素，如表4所示。

表3 439例肺腺癌患者臨床及病理指標(biāo)的單因素生存分析

表4 439例肺腺癌患者臨床及病理指標(biāo)的多因素生存分析

3 討論

計(jì)算機(jī)輔助DNA倍體分析在細(xì)胞病理學(xué)診斷中發(fā)揮重要作用[7-10]，DNA 倍體異常代表腫瘤細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，屬于ErBb 家族，EGFR基因突變與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有著密切關(guān)聯(lián)。研究肺腺癌腫瘤細(xì)胞DNA 倍體異常與EGFR突變及預(yù)后的關(guān)系可以為肺腺癌患者個(gè)體化治療提供重要預(yù)測(cè)信息。

隨著人工智能的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)基于病理圖像可以預(yù)測(cè)腫瘤相關(guān)指標(biāo)，包括基因突變、分子亞型、治療效果等[11-13]。王荃等[14]的研究結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌的病理圖像可以預(yù)測(cè)EGFR基因突變。DNA倍體分析作為一種低級(jí)別人工智能，本研究探索了基于DNA 倍體異常預(yù)測(cè)EGFR基因突變的可能性。有研究表明DNA 異倍體與EGFR基因突變狀態(tài)有關(guān)，EGFR突變患者DNA 異倍體比例較野生型患者更高[15]。在本研究中，在大于5c細(xì)胞的百分比、大于9c細(xì)胞的數(shù)目、最大DI 值、大于5c 細(xì)胞的平均DI 值不同組別中，高值組的患者EGFR突變率高于低值組的患者，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道結(jié)果一致。與EGFR野生型患者相比，EGFR突變型的大于5c 細(xì)胞的百分比、大于9c細(xì)胞的數(shù)目、最大DI 值、大于5c 細(xì)胞的平均DI 值和非整倍體細(xì)胞峰數(shù)的平均秩次更高。在EGFR不同突變組間，21號(hào)外顯子突變的大于9c細(xì)胞的數(shù)目平均秩次高于其他突變組，而在其他DNA 倍體異常指標(biāo)中EGFR不同突變組間無(wú)明顯差異。EGFR突變與各DNA倍體異常指標(biāo)均存在較弱的正相關(guān)關(guān)聯(lián)。這表明DNA倍體異常與EGFR基因突變有著一定的相關(guān)性，在一定程度上可以用來(lái)預(yù)測(cè)EGFR基因突變。

在一項(xiàng)有關(guān)96例I～I(xiàn)IIA期手術(shù)切除NSCLC患者的研究中[16]，在單因素分析中大于5c 細(xì)胞的百分比＜5%患者較大于5c 細(xì)胞的百分比≥5%患者有更高的OS，而在多因素分析后結(jié)果表明大于5c細(xì)胞的百分比并不能作為一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。單因素分析結(jié)果與本研究中的結(jié)果相反，可能與患者的臨床分期和大于5c細(xì)胞的百分比分界值不同有關(guān)，而多因素分析結(jié)果與本研究結(jié)果一致。在本研究中，單因素生存分析結(jié)果顯示，大于5c細(xì)胞的百分比≥14%、大于9c細(xì)胞的數(shù)目≥8的患者預(yù)后好于大于5c細(xì)胞的百分比＜14%、大于9c 細(xì)胞的數(shù)目＜8 的患者，EGFR突變型患者預(yù)后好于EGFR野生型患者。但多因素生存分析結(jié)果顯示，DNA倍體異常與晚期肺腺癌患者OS無(wú)關(guān)，EGFR基因突變組OS 的HR=0.576(95% CI 為0.465～0.714，P＜0.05)，這表明EGFR基因突變是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，而DNA倍體異常并不是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。DNA倍體異常與預(yù)后的關(guān)系在單因素和多因素分析中結(jié)果不同，這可能是因?yàn)镈NA 倍體異常與EGFR基因突變關(guān)聯(lián)密切有關(guān)，DNA 倍體異常作為一個(gè)混雜因素在多因素生存分析中被剔除。

一項(xiàng)薈萃分析[17]表明，在肺癌手術(shù)患者中，與EGFR野生型患者相比，EGFR突變患者OS 更長(zhǎng)。此外，一項(xiàng)關(guān)于5780例早期非鱗狀NSCLC 患者的回顧性研究[18]發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期和OS 比野生型患者均顯著延長(zhǎng)。這與本研究結(jié)論相符，在本研究中，晚期肺腺癌患者EGFR突變組的OS優(yōu)于非突變組。而許麗莉等[19]的研究結(jié)果顯示在早期肺腺癌患者中，EGFR突變狀態(tài)與患者術(shù)后無(wú)病生存期及OS無(wú)顯著相關(guān)性，不是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，但相比EGFR外顯子21 L858R 突變患者，EGFR外顯子19 缺失患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。Ito等[20]的一項(xiàng)多中心回顧性分析發(fā)現(xiàn)在病理分期IA～I(xiàn)B 期的高度惡性亞型和病理分期ⅡA～ⅢA期病例中，單因素和多變量分析顯示EGFR突變患者的5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率低于EGFR野生型患者。EGFR突變狀態(tài)在肺癌患者中的預(yù)后影響存在明顯爭(zhēng)議，可能是由于肺癌患者的分期及組織學(xué)亞型不同，或者患者攜帶有其他驅(qū)動(dòng)基因突變，這些因素均會(huì)影響研究結(jié)果。

本研究中年齡和吸煙史與晚期肺腺癌患者預(yù)后有關(guān)，年齡＜62 歲患者預(yù)后好于年齡≥62 歲的患者；無(wú)吸煙患者預(yù)后好于吸煙患者，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道相符。但本文僅隨訪了患者OS，并未統(tǒng)計(jì)患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間，可能會(huì)使結(jié)果存在一定的局限性，后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，增加患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間指標(biāo)，進(jìn)一步分析DNA 倍體異常與EGFR基因突變對(duì)患者預(yù)后的影響。

晚期肺腺癌患者常常較難獲得組織學(xué)標(biāo)本，本研究采用胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行DNA 倍體異常與EGFR突變檢測(cè)，將DNA 倍體異常與EGFR突變進(jìn)行相關(guān)性分析，并用COX單因素和多因素生存模型分析兩者與預(yù)后的關(guān)系，為晚期肺腺癌患者的預(yù)后及精準(zhǔn)治療提供了依據(jù)。

總而言之，晚期肺腺癌患者中EGFR基因突變與DNA 倍體異常存在關(guān)聯(lián)，DNA 倍體異常是預(yù)測(cè)EGFR基因突變的潛在指標(biāo)。DNA倍體異常不是晚期肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，而EGFR基因突變患者預(yù)后好于野生型患者，可作為晚期肺腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。