蔣 偉，李白玉

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙 410007）

葉酸是人體所必需的一種B族維生素，其在代謝循環(huán)過(guò)程中的作用非常重要。人體缺乏葉酸會(huì)導(dǎo)致各種各樣的問(wèn)題，包括巨幼細(xì)胞貧血、神經(jīng)管畸形等疾病[1]。葉酸無(wú)法由人體自身合成，只能從外界攝取，一般從食物中得到[2]。因此，人體對(duì)于葉酸的攝入狀況是非常值得注意的問(wèn)題。蔬菜是人類(lèi)獲取葉酸的重要來(lái)源之一[3]，了解當(dāng)?shù)爻Ｒ?jiàn)蔬菜的葉酸含量對(duì)于指導(dǎo)人們?nèi)粘Ｑa(bǔ)充葉酸具有重要意義。本文以某地區(qū)較常食用的蔬菜作為研究材料，通過(guò)微生物法使用鼠李糖乳桿菌測(cè)定分析蔬菜中葉酸的含量[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC7469）；菌種儲(chǔ)備瓊脂培養(yǎng)基：Becton，Dickinson and Company；葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基：海博生物公司。葉酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.7%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

磷酸鹽緩沖液終濃度為0.05 mol·L-1，pH 6.8；氫氧化鈉乙醇溶液終濃度為0.01 mol·L-1；蛋白酶-淀粉酶液配比為200 mg木瓜蛋白酶、200 mg α-淀粉酶、20 mL磷酸鹽緩沖液，蛋白酶-淀粉酶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配；氫氧化鈉-乙醇溶液中氫氧化鈉終濃度為1 mol·L-1，乙醇溶液中乙醇與水的體積配比為2∶8。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌菌種的活化

使用菌種儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基活化鼠李糖乳桿菌，具體方法是36 ℃培養(yǎng)1 d，并用相同的方法傳種2次。最新的菌株即儲(chǔ)備菌株，保存于4 ℃環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前兩天，將儲(chǔ)備菌株活化，使用同種培養(yǎng)基于36 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 d。

正式實(shí)驗(yàn)的前一天，將活化的菌株轉(zhuǎn)種至液態(tài)培養(yǎng)液中進(jìn)一步活化增殖，36 ℃培養(yǎng)1 d。取0.5 mL活化增殖后的菌種轉(zhuǎn)種至5 mL無(wú)菌的葉酸測(cè)定培養(yǎng)基，不添加葉酸，36 ℃培養(yǎng)6 h即得接種液。此步驟注意無(wú)菌操作，培養(yǎng)時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，確保接種液中殘存的多余葉酸被消耗掉。

1.2.2 葉酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

將葉酸標(biāo)準(zhǔn)品先用氫氧化鈉-乙醇溶液逐級(jí)稀釋為濃度0.200 μg·mL-1的中間液，再用水將中間液稀釋為終濃度0.200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，注意此工作液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。葉酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制體系見(jiàn)表1，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)平行，即標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定管。后續(xù)混菌及加入培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟與樣品測(cè)定管采用相同操作。待檢測(cè)工作完成后，以標(biāo)準(zhǔn)管的葉酸含量作橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的吸光值均值作縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)系列管的配制

1.2.3 蔬菜樣品制備與測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)所用的蔬菜全部購(gòu)自某地區(qū)的菜市場(chǎng)及超市。將買(mǎi)來(lái)的新鮮蔬菜分別勻漿混勻，稱(chēng)取適量蔬菜試樣轉(zhuǎn)進(jìn)適當(dāng)大小的錐形瓶，加入30 mL磷酸緩沖液，搖勻，121 ℃高壓水解15 min。待錐形瓶冷卻至室溫，繼續(xù)加入蛋白酶-淀粉酶液和雞胰腺液各1 mL，搖勻后加入甲苯4滴，36 ℃恒溫酶解20 h。將所有內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，加水定容，過(guò)濾。另準(zhǔn)備單獨(dú)的錐形瓶同上操作，不加樣品，即酶空白液。最終的待測(cè)液需要根據(jù)試樣中葉酸的含量進(jìn)一步進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)郎y(cè)液最佳葉酸含量需要控制在0.2～0.3 ng·mL-1。

每個(gè)樣品的待測(cè)液需要做3個(gè)不同濃度梯度的測(cè)定系列管，具體測(cè)定系列管的配制見(jiàn)表2，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)平行，另取3支試管加入酶空白液。將葉酸測(cè)定培養(yǎng)基和全部測(cè)定管分別121 ℃高壓滅菌15 min，待兩者都降溫到室溫后，將接種液按4 mL·L-1的比例混入葉酸測(cè)定培養(yǎng)基，混勻，接著將培養(yǎng)基按5 mL/管的量分裝到各測(cè)定管，再次混勻。放入36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一天，直到混濁度最大時(shí)拿出測(cè)定吸光值。另備一支既不接種也不含葉酸的標(biāo)準(zhǔn)管作0對(duì)照管。培養(yǎng)結(jié)束后，各系列管需要在測(cè)定前再次漩渦，將紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)調(diào)至540 nm處測(cè)定吸光值，留意用0對(duì)照管調(diào)零。按葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出各樣品待測(cè)液濃度，再按照處理步驟中不同的稀釋倍數(shù)，換算求出每100 g新鮮蔬菜中葉酸的含量。

表2 樣品測(cè)定系列管的配制

2 結(jié)果與分析

2.1 蔬菜葉酸含量測(cè)定結(jié)果

在某地區(qū)不同的菜市場(chǎng)和超市中購(gòu)得常見(jiàn)的25種蔬菜，具體檢測(cè)得到的葉酸含量平均值見(jiàn)表3。由表3可知，菠菜葉酸含量最為豐富，為236.0 μg/100 g；其次為西蘭花，葉酸含量為137.0 μg/100 g。其余蔬菜的葉酸含量都低于100 μg/100 g。

表3 不同種類(lèi)蔬菜的葉酸含量

2.2 不同品種蔬菜的葉酸含量比較

此次檢測(cè)的25種不同種類(lèi)的蔬菜，葉酸含量平均值為10.7～236.0 μg/100 g，不同種類(lèi)的蔬菜葉酸含量差異較大。深色蔬菜以菠菜葉酸含量最為豐富，淺色蔬菜以大白菜的葉酸含量較為豐富。整體而言，深色蔬菜較淺色蔬菜的葉酸含量略高。相比豆類(lèi)、瓜類(lèi)和根莖類(lèi)蔬菜，葉類(lèi)蔬菜整體葉酸含量相對(duì)較高。

2.3 不同售賣(mài)途徑的同品種蔬菜葉酸含量比較

此次檢測(cè)的25種蔬菜，從整體上看，不同售賣(mài)途徑的同種蔬菜的葉酸含量也有明顯差異。例如，5處不同來(lái)源的菠菜，葉酸含量平均值為236.0 μg/100 g，實(shí)際含量為82.2～332.0 μg/100 g；5處不同來(lái)源的西蘭花，葉酸含量平均值為137.0 μg/100 g，實(shí)際含量為41.5～203.0 μg/100 g。推測(cè)蔬菜的葉酸含量不僅受到具體品種的影響，也會(huì)受到產(chǎn)地的種植環(huán)境、采摘后的運(yùn)輸儲(chǔ)存條件等因素的影響。

2.4 置放時(shí)間對(duì)葉酸含量的影響

為探討蔬菜置放后葉酸是否有流失，選取菠菜和大白菜在置放一周后重新測(cè)定葉酸含量，發(fā)現(xiàn)菠菜葉酸平均含量由236.0 μg/100 g下降至54.3 μg/100 g，殘留率僅為23.0%；大白菜葉酸平均含量由93.4 μg/100 g下降至40.1 μg/100 g，殘留率僅為42.9%。由此可見(jiàn)，新鮮蔬菜的葉酸含量并不穩(wěn)定，在置放過(guò)程中蔬菜里的葉酸會(huì)被逐漸消耗或分解。由此可以推測(cè)，蔬菜本身的新鮮程度會(huì)對(duì)葉酸的留存量產(chǎn)生較大影響，由較近產(chǎn)地直接運(yùn)來(lái)的較為新鮮的蔬菜，葉酸檢測(cè)值會(huì)相對(duì)較高。而經(jīng)過(guò)多重清理和運(yùn)銷(xiāo)作業(yè)等操作的蔬菜，尤其是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)運(yùn)的蔬菜，增加了葉酸被破壞的可能性，可能會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)蔬菜的葉酸檢測(cè)值偏低。

2.5 關(guān)于檢測(cè)方法的一些思考

微生物法檢測(cè)葉酸含量，本質(zhì)上檢測(cè)的是具有生物活性的多種葉酸母體及其衍生形式的總量。相比起儀器分析法針對(duì)單一組分的檢測(cè)，微生物法的數(shù)據(jù)能更好地反映蔬菜中天然葉酸的總量。微生物法檢測(cè)過(guò)程中，相關(guān)器皿的清潔程度非常重要，異物殘留會(huì)引起菌液的異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致定量失敗。建議實(shí)驗(yàn)中使用到的相關(guān)玻璃器皿，實(shí)驗(yàn)前先用硫酸重鉻酸甲溶液浸泡24 h以上，蒸餾水清洗后再用烘箱250 ℃干熱2 h。

3 結(jié)論

測(cè)定了25種人們經(jīng)常食用且容易購(gòu)買(mǎi)到的蔬菜的葉酸含量，結(jié)果顯示菠菜的葉酸含量最為豐富。葉酸含量雖因蔬菜而異，但大多數(shù)蔬菜中葉酸的含量在10～100 μg/100g。由于蔬菜是人們攝取葉酸的主要食物來(lái)源之一，因此本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可為初步估算人們?nèi)~酸攝取量提供參考。富含葉酸的葉類(lèi)蔬菜在置放一周后存在葉酸流失的情況，因此估算葉酸可獲率時(shí)，應(yīng)考慮蔬菜的食用時(shí)間以及保存狀況等信息。值得注意的是，近年來(lái)許多研究亦顯示葉酸在心血管等慢性疾病治療中扮演非常重要的角色[5]。因此，含葉酸食品的攝入量與人們患慢性疾病的相關(guān)性，以及增進(jìn)葉酸攝取對(duì)維護(hù)人體健康的效益，仍是待研究與了解的問(wèn)題。