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        河鲀肝油中維生素A、D檢測方法研究

        2023-06-08 04:05:00黃海楓范奕輝
        食品安全導(dǎo)刊 2023年13期
        關(guān)鍵詞:檢測

        黃海楓,夏 鑫*,范奕輝

        (1.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院(河北省海洋漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站),河北秦皇島 066000;2.河北省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室,河北秦皇島 066000;3.國立釜慶大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)學(xué)院食品工學(xué)部,釜山 612022)

        目前,國際上魚油的研究在其來源和活性分子、工作原理、分子靶標(biāo)等19個大項中開展,在多領(lǐng)域結(jié)出豐碩成果。BHATT等[1]在頂級醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中指出,正常健康人群服用魚油制劑有利于預(yù)防心血管疾病和糖尿病。河鲀肝油基本性狀與海產(chǎn)天然魚肝油相似,肝油中含有多種維生素、脂肪酸和微量的河鲀毒素(Tetrodotoxin,TTX),除毒去脂的河鲀肝油被證明在緩解癌痛、抑瘤、增強機體免疫力等方面藥理作用突出,且無毒性及成癮性反應(yīng)[2]。多年來,國內(nèi)外的研究大部分專注于TTX,對肝油中其他營養(yǎng)成分研究較少。其實河鲀肝油中不但富含多種脂肪酸,也含有維生素A、維生素D等保健性生物成分。在國際國內(nèi)雙循環(huán)格局下,食品營養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)正在從較低層次朝高附加值、高技術(shù)水平、高加工深度、高規(guī)模經(jīng)濟方向演變。高端食品、保健食品、功能食品發(fā)展加速,開展富含營養(yǎng)功能因子食品的新型工藝和質(zhì)量控制技術(shù)的研究及集成,研究開發(fā)產(chǎn)品質(zhì)量可控、環(huán)境友好的清潔生產(chǎn)工藝是科技發(fā)展的必然趨勢[3]。因此,如果能夠通過新型制備技術(shù)提取肝油并高值化利用開發(fā),變廢為寶,既能提升資源生物利用率,提高產(chǎn)業(yè)附加值,又可減少廢棄油脂對環(huán)境的污染,具有顯著的經(jīng)濟效益與生態(tài)效益。而河鲀肝油中的維生素A隨季節(jié)和生殖情況是有顯著變化的,如蟲紋東方鲀產(chǎn)卵前每克肝中含維生素A高達(dá)4 100國際單位(International Units,IU),產(chǎn)卵后降為960 IU[4]。因此,建立快速可靠、簡便易行的魚肝油質(zhì)量檢測方法,對有效評價河鲀魚肝油品質(zhì)優(yōu)劣、幫助人們合理使用魚油具有現(xiàn)實參考意義。本實驗通過亞臨界萃取設(shè)備提取河鲀肝油,并采用高效液相色譜法對河鲀肝油中維生素A1和維生素D3成分進(jìn)行檢測研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        河鲀肝臟(唐山海都);視黃醇(純度≥95%,阿拉丁);膽鈣化醇(純度≥99%,麥克林);甲醇(迪馬科技);無水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、抗壞血酸溶液、氫氧化鉀和無水硫酸鈉(均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑)。

        萃取設(shè)備(河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司CBE-5L型);Agilent1200高效液相色譜儀;HH-S型恒溫水浴振蕩器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(力辰科技RE-2000A型);KQ-400E超聲儀;Milli-Q純水處理器;JA1003型電子分析天平;H/T12MM型高速離心機。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 魚肝油制備方法

        選取處理好的河鲀肝臟1 kg,放入萃取罐啟用真空萃取程序,以丁烷為萃取溶劑,30 ℃萃取30~40 min,重復(fù)3~4次,結(jié)束脫溶后回收殘液增加提取率。用布氏漏斗重復(fù)抽濾去脂,澄清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶,100 ℃旋蒸至無水分餾出,得到純凈澄清河鲀肝油樣品備用。

        1.2.2 樣品處理

        (1)維生素A的提取。準(zhǔn)確稱取5 g魚肝油樣品,加入20 mL無水乙醇溶解稀釋搖勻。加入5 mL 10%抗壞血酸和10 mL氫氧化鉀溶液,于沸水浴回流30 min。將皂化液并入分液漏斗,用蒸餾水沖洗回流系統(tǒng),沖洗液并入分液漏斗中,用50 mL石油醚萃取,合并醚層用蒸餾水洗至中性液,經(jīng)無水硫酸鈉濃縮至干,加入甲醇溶解并定容至10 mL,用0.22 μm濾膜過濾后上機分析。當(dāng)樣品中同時存在幾種維生素A形式時,可通過堿水解的方式將其變成單一的視黃醇,以便于測定[5]。

        (2)維生素D的提取。準(zhǔn)確稱取5 g魚肝油樣品,加入50 mL正己烷渦旋混勻,放入高速冷凍離心機,4 ℃下以7 500 r·min-1離心5 min得到上清液。取5 mL上清液,使用0.22 μm濾膜過濾后待分析[6]。

        1.2.3 確立色譜條件

        (1)維生素A檢測條件的確立。色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);梯度洗脫:0~13 min,甲醇96%,13~20 min,甲醇96%→100%,20~24min,甲醇100%,24~24.5 min,甲醇100%→96%,24.5~30 min,甲醇96%;流速:0.8 mL·min-1;波長:325 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

        (2)維生素D檢測條件的確立。色譜柱:Waters Symmetry R-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);等度洗脫:0~30 min,甲醇96%;流速:1.0 mL·min-1;波長264 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

        1.2.4 色譜分析方法

        本實驗采用外標(biāo)法定量,配制不同濃度的維生素A、維生素D標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液,分別注入高效液相色譜儀中,測定響應(yīng)的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定樣品中維生素A、維生素D的含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜條件的優(yōu)化

        對肝油分離效果產(chǎn)生影響的主要因素包括色譜柱類型、柱容量、流動相流速、流動相組成和比例。本實驗主要考察了色譜柱類型、流動相比例、流動相流速對肝油分離效果的影響。

        2.1.1 維生素A檢測條件的優(yōu)化

        (1)色譜柱的篩選。不同的色譜柱分離效果不同,本實驗中使用兩種常用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18、Waters Symmetry R-C18對樣品中維生素A、維生素D進(jìn)行分離,并比較分離效果。將4 μg·mL-1維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀,對比兩柱的分析效果(圖1)。兩柱都在10 min內(nèi)出峰完全。使用Agilent柱時,維生素A的保留時間為7.152 min,峰面積為783.2,對稱因子為1.048,峰形較好;使用Waters柱時,維生素A的保留時間為8.591 min,峰面積為175.4,對稱因子為1.001,但出現(xiàn)了雙峰連在一起的情況。經(jīng)對比,選擇Agilent柱對維生素A進(jìn)行檢測。

        圖1 使用不同色譜柱檢測維生素A效果

        (2)流動相比例的優(yōu)化。使用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱,調(diào)節(jié)流動相中甲醇與水比例為95∶5、96∶4、98∶2,比較不同流動相條件下維生素A的分離效果(圖2)。當(dāng)甲醇∶水=95∶5時,圖中出現(xiàn)雙峰,基線較不平穩(wěn);當(dāng)甲醇∶水=96∶4時,峰形最佳,出峰時間比較合適。當(dāng)甲醇∶水=98∶2時,維生素A出峰時間過早且基線不平穩(wěn)。經(jīng)對比選擇甲醇∶水=96∶4為流動相進(jìn)行維生素A的檢測。

        圖2 使用不同流動相比例檢測維生素A效果

        (3)流速的優(yōu)化。流速是影響目標(biāo)物峰形的重要因素之一,流速增大目標(biāo)物的出峰時間會隨之提前,峰形變得尖銳,如流速過大,易造成柱壓過高,影響峰形美觀,也會縮短色譜柱的使用壽命[7]。將1 μg·mL-1的維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜,調(diào)整流速為0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進(jìn)行分析(圖3)。

        圖3 使用不同流速檢測維生素A效果

        當(dāng)流速為0.5 mL·min-1時,維生素A出現(xiàn)雙峰難以分離的情況;流速為0.8 mL·min-1時,出峰時間合適,基線較平,峰形較好;流速為1 mL·min-1時,出峰時間較早,且基線不平穩(wěn);流速為1.5 mL·min-1時,出峰時間過早,基線不平且柱壓過大。經(jīng)對比選用0.8 mL·min-1的流速進(jìn)行維生素A的檢測。

        2.1.2 維生素D檢測條件的優(yōu)化

        (1)色譜柱的篩選。將200 μg·mL-1的維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜,使用兩個品牌的色譜柱進(jìn)行分離效果比較(圖4)。結(jié)果表明,兩柱檢測維生素D均可在30 min內(nèi)出峰完全。使用Agilent柱時,維生素D的保留時間為19.555 min,峰面積為9 596.4,對稱因子為0.415,峰形外觀較差;使用Waters柱時,維生素D的保留時間為20.210 min,峰面積為6 490.6,對稱因子為1.097,峰形外觀較規(guī)整,出峰時間合適,響應(yīng)更高。經(jīng)對比選擇Waters色譜柱進(jìn)行維生素D的檢測。

        圖4 使用不同色譜柱檢測維生素D效果

        (2)流動相比例的優(yōu)化。以Waters Symmetry R-C18色譜柱作分析柱,設(shè)流動相甲醇∶水為95∶5、96∶4、98∶2,測定維生素D(圖5)。

        圖5 使用不同流動相比例檢測維生素D效果

        當(dāng)流動相為甲醇∶水=95∶5時,峰形較好,但出峰時間較晚;當(dāng)流動相為甲醇∶水=96∶4時,出峰時間比較合適,峰形較好,且相鄰峰之間影響較小。當(dāng)流動相比例為甲醇∶水=98∶2時,峰形較差,有雙峰相連現(xiàn)象。經(jīng)對比選擇甲醇∶水=96∶4為流動相進(jìn)行維生素D的檢測。

        (3)流速的優(yōu)化。將200 μg·mL-1的維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜,調(diào)整流速為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進(jìn)行色譜分析(圖6)。當(dāng)流速為0.5 mL·min-1時,出峰很小且峰形難看;流速為1.0 mL·min-1時,峰形好看,分離情況良好;流速為1.5 mL·min-1時,峰形較好但雜質(zhì)峰很大并顯示柱壓過高。經(jīng)對比選擇1.0 mL·min-1的流速進(jìn)行維生素D檢測。

        圖6 使用不同流速檢測維生素D效果

        2.2 檢測結(jié)果

        2.2.1 維生素A檢測結(jié)果

        選Agilent Eclipse XDB-C18柱為分析柱,流動相為甲醇∶水(96∶4),流速為0.8 mL·min-1,建立維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線,線性回歸方程為y=103.478 87x-3.567 22。結(jié)果顯示維生素A在0.2~6.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線,以同一份樣品同天內(nèi)檢測5次,檢測結(jié)果為0.74 mg/100 g、0.75 mg/100 g、0.76 mg/100 g、0.74 mg/100 g和0.76 mg/100 g,維生素A的平均含量為0.75 mg/100 g,日內(nèi)精密度(RSD)為1.3%。

        2.2.2 維生素D檢測結(jié)果

        選Waters Symmetry R-C18柱分析,流動相甲醇∶水(96∶4),流速1.0 mL·min-1,建立維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線,線性回歸方程為y=111.998 66x-63.620 36,結(jié)果顯示維生素D在1~200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.998 5。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線,以同一份樣品同天內(nèi)檢測5次,結(jié)果為0.70 mg/100 g、0.68 mg/100 g、0.69 mg/100 g、0.70 mg/100 g和0.68 mg/100 g,維生素D的平均含量為0.69 mg/100 g,日內(nèi)精密度(RSD)為1%。

        3 結(jié)論

        本實驗通過亞臨界萃取法制備河鲀肝油,利用HPLC法檢測魚肝油樣品中維生素A及維生素D的含量。通過對不同色譜柱、流動相比例、流速大小的分析篩選,優(yōu)化得到最佳色譜條件,測得樣品中維生素A平均含量為0.75 mg/100 g,維生素D平均含量為0.69 mg/100 g。本方法綠色環(huán)保,簡便易行,能滿足對魚肝油中維生素A及維生素D含量檢測的要求,并可為進(jìn)一步研究此類功能性油脂提供參考。

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