毛艷萍，李玉嬋，楊玉萍,3，李 歡,3，張翼冠，侯大斌,3*

1. 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000

2. 綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川 綿陽 621000

3. 阿壩州西科道地中藥材產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新中心，四川 阿壩 624000

4. 四川省中醫(yī)院轉(zhuǎn)化研究醫(yī)學中心，四川 成都 610041

北柴胡Bupleurumchinense DC.又名韭葉柴胡，是柴胡的優(yōu)質(zhì)來源，其主根粗大且分支較多，表面棕褐色，質(zhì)地較硬，主要分布于我國的東北、西北、華東和華中地區(qū)，多生于樹林邊緣或灌叢下，其根是我國大宗藥材柴胡主要藥材來源，具有解熱鎮(zhèn)痛、護肝利膽、抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[1-2]。柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，其合成與其他三萜皂苷一樣，需要先通過甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑以及2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑產(chǎn)生2,3-氧化鯊烯，2,3-氧化鯊烯再被不同的氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclase，OSC）環(huán)化形成構(gòu)型和功能各異的三萜骨架，三萜骨架最后再經(jīng)過細胞色素單加氧酶（cytochrome P450 enzyme，P450）和糖基轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glycosyltransferase，UGT）的后修飾，形成不同的三萜皂苷[3]。OSC 是決定形成三萜皂苷骨架的重要節(jié)點，β-香樹脂醇合酶（β-amyrin synthase，β-AS）為環(huán)化酶OSC 的一員，可催化MVA及MEP 途徑產(chǎn)生的2,3-氧化鯊烯形成柴胡皂苷的骨架β-香樹脂醇，是形成柴胡皂苷骨架的關鍵分支節(jié)點酶。目前，現(xiàn)已從不同的21 個植物家族37 個種中克隆出超過60 個β-AS基因[4]，但北柴胡β-AS基因家族篩選及功能驗證的研究報道甚少。

本研究基于北柴胡轉(zhuǎn)錄組測序，對北柴胡β-AS基因進行全面的鑒定，了解其結(jié)構(gòu)預測其功能，進一步利用大腸桿菌對BcBAS1進行了原核表達，并利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化研究其功能。為進一步揭示柴胡皂苷合成路徑和調(diào)控機制奠定基礎，為實現(xiàn)柴胡皂苷的生物合成提供思路。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試材料經(jīng)西南科技大學侯大斌教授鑒定為北柴胡B.chinense DC.品種，種植于四川省綿陽市西南科技大學藥用植物研究實驗室的試驗田。本氏煙草種植于四川省綿陽市西南科技大學藥用植物研究實驗室溫室中。

1.2 試劑

同源重組試劑盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）購于諾唯贊生物科技有限公司，各種限制性內(nèi)切酶及抗生素均購于全式金生物，β-香樹脂醇標準品購于上海源葉生物科技有限公司。大腸桿菌原核表達載體為pMALC5E，菌株為BL21（DE3）。煙草瞬時表達載體為pCAMBIA1300S，菌株為GV3101。

2 方法

2.1 北柴胡β-AS 基因家族鑒定

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq 測序數(shù)據(jù)[5]，轉(zhuǎn)錄組獲取的數(shù)據(jù)在GO、KEGG、KOG、NR、NT、SwissProt、Pfam 共7 個數(shù)據(jù)庫（e-value≤1×10-5）進行Blast 比對初篩，利用NCBI 保守域數(shù)據(jù)庫和Blast 比對，篩選具有保守結(jié)構(gòu)域及完整CDS 的數(shù)據(jù)。確保每個序列均具有保守結(jié)構(gòu)域且具有完整的CDS 區(qū)域，在此基礎上剔除冗余，最終得到的序列被認定北柴胡β-AS基因家族成員。

2.2 北柴胡β-AS 基因生物信息學分析

利用在線軟件ProtParam 對北柴胡β-AS基因的氨基酸數(shù)量、等電點、相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)進行分析計算。利用在線軟件WoLF PSORT 預測北柴胡β-AS基因編碼蛋白的亞細胞定位。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)域分別用在線軟件SOPMA和Phyre2 進行分析。蛋白質(zhì)保守域基序利用在線軟件MEME 分析，參數(shù)設置：Motif 設置為10 個，長度設置為100 氨基酸，其他設置為默認值。SMART 分析得到序列的蛋白結(jié)構(gòu)域，并利用TBtools 軟件將分析得到的結(jié)構(gòu)域可視化。從NCBI中下載已驗證功能的其他物種β-AS 氨基酸序列，利用MEGAx 軟件，設置bootstrap 法的值為1000，用Neighbor-Joining Tree 進行進化樹構(gòu)建。利用DNAMAN 軟件對β-AS基因序列進行多序列比對分析。

2.3 表達載體構(gòu)建

以前期構(gòu)建的T-BcBAS1 質(zhì)粒為模板[6]，擴增相關目的基因片段。原核表達載體構(gòu)建基因片段擴增 引 物 為 F：5’-AAGGTACCGCATATGTCCATGTGGAGATTGAAAATCGGTGA-3’，R：5’-ATTACCTGCAGGGAATTCTTAATGGTGATGGTGATGATGGATGGTTGAAGATGGAAGTG-3’。煙草表達擴增目的片段的引物 F：5’-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGTGGAGATTGAAAATCGGTG-3’及 R：5’-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTAGATGGTTGAAGATGGAAGTGC-3’。BamHI 和EcoRV 雙 酶 切 載 體 pMALC5E ， 載 體pCAMBIA1300S 用限制性內(nèi)切酶KpnI 和BamHI 雙酶切處理，線性化載體并回收。利用同源重組試劑盒連接目的片段與線性化的載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過菌落PCR 確定陽性克隆并測序。

2.4 重組蛋白表達

測序正確的pMALC5E-BcBAS1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達大腸桿菌BL21（DE3），以空載轉(zhuǎn)化作為對照。挑取含正確的單克隆接種于Kana 抗性的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600＝0.6～0.8。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度為 0.5 mmol/L，16 ℃、160 r/min 震蕩培養(yǎng)16 h 誘導蛋白。培養(yǎng)結(jié)束，收集菌液，冰浴超聲破碎儀170 Hz 破碎，至菌液澄清，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。利用Ni-NTA Resin 純化蛋白，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白純化情況。

2.5 煙草過表達

煙草過表達載體pC1300S-BcBAS1 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，測序正確的農(nóng)桿菌單克隆在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，取1 mL 農(nóng)桿菌菌液至20 mL 含有15 μmol/L AS 的LB 培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 震蕩擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至農(nóng)桿菌A600＝0.5～0.6。5000 r/min離心10 min收集菌體，用浸染液（含10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，150 μmol/L AS，pH 5.6）重懸菌體至A600為1.0，用注射器針頭煙草葉片背面輕輕點開一個小口，去掉針頭注射農(nóng)桿菌侵染葉片。培養(yǎng)2 d 后，取侵染區(qū)域的葉片進行代謝產(chǎn)物檢測，以空載侵染及野生型葉片作為對照。

2.6 數(shù)據(jù)分析

用FPKM 值表示β-AS基因表達量，均一化處理后使用R 軟件制作熱圖，將其表達量可視化。每個實驗均設置3 個生物學重復，使用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析及差異顯著性分析（P＜0.05）。

3 結(jié)果與分析

3.1 北柴胡β-AS 基因家族鑒定

根據(jù)7 個數(shù)據(jù)庫的初篩，通過進一步的完整性篩選，剔除重復序列后，共獲得北柴胡β-AS基因家族成員6 個，分別命名為BcBAS1～BcBAS6。對北柴胡β-AS 家族基因編碼的蛋白進行理化性質(zhì)分析（表1）表明，北柴胡β-AS基因編碼蛋白平均長度為764.8 個氨基酸，最大的編碼蛋白（BcBAS5）由784 個氨基酸組成，最小的編碼蛋白（BcBAS4）由755 個氨基酸組成，蛋白相對分子質(zhì)量范圍86 880～90 490，等電點均大于5.89，BcBAS5 基因編碼蛋白具有最大等電點6.22，BcBAS4基因編碼蛋白具有最小等電點5.89。亞細胞預測結(jié)果顯示，所有北柴胡β-AS 家族基因編碼蛋白均預測在細胞質(zhì)中。北柴胡β-AS 家族基因的理化性質(zhì)符合β-AS的特性。

表1 北柴胡β-AS 基因基本信息Table 1 Basic information of β-AS from B. chinense

3.2 北柴胡β-AS 同源進化分析及序列比對

為了評估北柴胡β-AS 同源進化關系，本課題組加入了擬南芥、水稻、人參、甘草、燕麥等42 個已驗證功能的β-AS 的氨基酸序列，與本研究鑒定的6個北柴胡β-AS 氨基酸序列，構(gòu)建了進化樹并對進行蛋白質(zhì)序列進行了分析（圖1）。進化樹結(jié)果表明，所有的β-AS 基因可分為4 個亞家族BcBAS1、BcBAS2、BcBAS4、BcBAS5、BcBAS6均位于Class I，BcBAS3位于Class III。從進化距離來看，BcBAS2、BcBAS4與BcBAS6在同一個分支上，與崗梅β-AS基因IaAS2關系最近；BcBAS1和BcBAS5在一個分支上，與番茄β-AS基因有最近的親緣關系；BcBAS3與其他北柴胡β-AS基因關系較遠，與秋茄樹的β-AS基因最接近。

圖1 北柴胡β-AS 和其他物種編碼蛋白的進化關系Fig. 1 Evolution relationship of β-AS with other β-AS proteins

從各亞家族的功能來看，Class I 包含了27 個β-AS基因，主要為單功能β-AS，其產(chǎn)物僅有β-香樹脂醇，或以β-香樹脂醇為主，僅有少量的其他產(chǎn)物，由此推測BcBAS1、BcBAS2、BcBAS4、BcBAS5、BcBAS6有可能為單功能β-AS。Class II 和Class III分別包含了6、10 個β-AS基因，均為多功能β-AS，功能驗證實驗顯示均能催化底物產(chǎn)生2 種以上產(chǎn)物，推測BcBAS3可能為多功能β-AS。Class IV 包含了5 個β-AS基因，所包含基因的催化產(chǎn)物既有單一的β-香樹脂醇，也有同時催化產(chǎn)生了其他產(chǎn)物。北柴胡β-AS基因同源進化分析表明，北柴胡β-AS基因大多在同一亞家族，進化距離較近，在進化的過程中變異可能不大。

將北柴胡β-AS基因的保守區(qū)域序列與擬南芥[7]、北柴胡[8]、甘草[9]、人參[10]的氨基酸序列在DNAMAN 中進行多序列比對。結(jié)果表明（圖2），北柴胡β-AS基因家族顯示包含OSC 的典型保守區(qū)域，含1 個基質(zhì)結(jié)合基序真核OSC 中高度保守的DCTAE 基序，含有1 個β-AS基因標志性基序MWCYCR，含多個加強酶的結(jié)構(gòu)并穩(wěn)定其碳陽離子中間體的基序QW[11-12]。北柴胡β-AS與其他近源物種一樣，在漫長進化的過程保留了必要的功能區(qū)域。

圖2 北柴胡β-AS 基因與其他物種的β-AS 基因多序列比對Fig. 2 Comparison of deduced amino acid sequences of β-AS from B. chinense with β-AS from other plants

3.3 北柴胡β-AS 蛋白結(jié)構(gòu)分析

為了進一步了解北柴胡β-AS 蛋白的特征，利用在線軟件SMART和MEME對北柴胡β-AS蛋白分析。結(jié)果顯示，北柴胡β-AS 蛋白所含保守結(jié)構(gòu)的數(shù)量和位置大多相似（圖3）。BcBAS3含有最多的基序，BcBAS5基序最少。所有北柴胡β-AS 蛋白都含有OSC的保守N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域，以及OSC 特定的氨基酸重復序列[13-14]。對北柴胡β-AS 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測。二級結(jié)構(gòu)分析表明（表2），北柴胡β-AS 蛋白α-螺旋所占比例最大，其次是無規(guī)則的卷曲，所占比例最低的是β-折疊，北柴胡β-AS的序列相似。三級結(jié)構(gòu)表明（圖4），二級結(jié)構(gòu)進一步折疊較規(guī)律，形成的結(jié)構(gòu)也相似，說明北柴胡β-AS編碼蛋白可能具有相似的功能。

圖3 北柴胡β-AS 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和motif 分析Fig. 3 Conserved putative motif analysis of β-AS domain proteins in B. chinense

圖4 北柴胡β-AS 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig. 4 Prediction of tertiary structures of β-AS proteins

3.4 北柴胡β-AS 基因表達分析

為了了解北柴胡β-AS基因表達差異，從北柴胡茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出β-AS基因表達數(shù)據(jù)繪制熱圖（圖5）。數(shù)根據(jù)熱圖分析，北柴胡β-AS基因在根和葉中的表達模式，可將北柴胡β-AS基因分為3 個亞組。BcBAS5單獨為一個亞組，在葉中的表達水平更高，表達量最高出現(xiàn)在24 h。BcBAS3、BcBAS6一個亞組，在根中的表達水平顯著高于在葉中的表達水平，且在根中持續(xù)高表達，有一定的組織表達特異性。BcBAS1、BcBAS2和BcBAS4為一個亞組，該亞組也主要在根中表達，受MeJA 處理的響應更顯著。結(jié)果表明，BcBAS1、BcBAS2、BcBAS3、BcBAS4和BcBAS6基因在根中的表達受到MeJA 處理顯著的誘導，BcBAS5則表現(xiàn)出在葉中的表達受到MeJA 處理影響更顯著。

圖5 北柴胡β-AS 基因表達分析Fig. 5 Expression analyses of β-AS gene in B. chinense

3.5 北柴胡BcBAS1 重組蛋白表達

本研究成功構(gòu)建原核表達載體pMALC5E-BcBAS1（圖6-A），SDS-PAGE 結(jié)果顯示在120 000 附近有明顯的蛋白條帶（圖6-B），蛋白條帶大小約為119 000（MBP 標簽42 000+目的蛋白87 000），為可溶性蛋白，目的蛋白大小與預期的一致。結(jié)果表明，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達了BcBAS1可溶性蛋白。

圖6 BcBAS1 基因原核蛋白表達分析Fig. 6 SDS–PAGE analysis of expressed recombinant protein of BcBAS1

3.6 北柴胡BcBAS1 基因在煙草過表達

測序無誤的煙草過表達載體 pC1300SBcBAS1 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，菌落PCR 顯示載體轉(zhuǎn)入成功（圖7-A）。將pC1300S-BcBAS1 在煙草葉片中瞬時表達，以空載pCAMBIA1300S 轉(zhuǎn)入煙草和野生型煙草作為對照，對β-香樹脂醇含量進行測定。結(jié)果表明（圖7-B），與對照的煙草葉片和野生煙草葉片相比，轉(zhuǎn)入pC1300S-BcBAS1載體的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中β-香樹脂醇含量顯著增加，分別是空載對照和野生型的1.77 和1.70 倍。說明β-香樹脂醇含量的增加是由BcBAS1基因調(diào)控產(chǎn)生，BcBAS1在異源煙草葉片中有效的行使β-AS 的催化功能，促進 β-香樹脂醇的積累，BcBAS1基因為編碼β-AS基因。

圖7 BcBAS1 基因在煙草過表達分析Fig. 7 Overexpression analysis of BcBAS1 gene in tobacco

4 討論

三萜化合物是一類重要的次生代謝物廣泛存在于植物中，其合成調(diào)控過程復雜，涉及到多途徑多個酶的參與。β-AS 負責齊墩果烷型三萜化合物的骨架構(gòu)建，對植物三萜的合成類型具有決定性的重要作用，深入研究β-AS 可以幫助人們深入分析三萜化合物的生物合成途徑以提高三萜化合物的積累，對β-AS 家族進行鑒定具有重要意義。北柴胡作為亞洲地區(qū)重要的中藥資源植物，其β-AS基因家族研究仍是空白。本研究共篩選出6 條非冗余的編碼區(qū)完整的北柴胡β-AS基因，根據(jù)已有報道其他植物中β-AS 約有760 個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量約為87 000，等電點范圍5.70～6.30[4]，本研究篩選的6條編碼β-AS基因的相關理化性質(zhì)與之前報道其他的β-AS基因一致。多序列比對表明，北柴胡β-AS均包含了1 個DCTAE、1 個MWCYCR 和多個QW基序，這個結(jié)果與已驗證功能的北柴胡β-AS基因BcBAS（GenBank 登錄號：MN186093）[8]在基序的種類和數(shù)量上極為相似，且在進化分析中與BcBAS親緣關系較近，預測本研究篩選出的北柴胡β-AS也具有與BcBAS相似的功能。

不同植物的β-AS基因在不同組織中的表達存在差異性，苜蓿β-AS基因在不同組織中的表達分析表明其在芽分生組織和莖的轉(zhuǎn)錄水平最高[15]；藤茶β-AS基因在葉片中表達量最高，莖次之，根中表達量最少[16]；北柴胡β-AS基因在根、莖、葉、花、果中均有表達，大多數(shù)北柴胡β-AS基因在根中表達量顯著高于其他組織[17-18]。本研究篩選的6 條β-AS基因中的5條β-AS基因在根中的表達量顯著高于在葉中的表達量，與之前北柴胡研究中β-AS基因的表達部位一致。柴胡皂苷主要產(chǎn)生的部位是根，β-AS基因是柴胡皂苷合成通路基因，主要在根中顯著表達，顯示了其在根中旺盛的表達可能影響柴胡皂苷的合成。

已有研究表明，植物界很多物種的β-AS基因已被成功克隆并誘導了蛋白表達，如遼東楤木[19]、秦艽[20]、竹節(jié)人參[21]等，蛋白大小87 000～90 000。北柴胡β-AS基因BcBAS1主要在根中表達且對MeJA 響應顯著，BcBAS1也是課題組前期北柴胡比較轉(zhuǎn)錄組研究中篩選出的唯一一個北柴胡β-AS差異基因，具有進一步研究價值。本研究成功對BcBAS1進行了原核蛋白表達，蛋白相對分子質(zhì)量約87 000，與其他物種β-AS基因表達蛋白大小一致。利用本氏煙草通過煙草瞬時表達BcBAS1，轉(zhuǎn)基因型煙草葉片中β-香樹脂醇產(chǎn)量顯著高于野生型和空載轉(zhuǎn)化煙草葉片，進一步表明BcBAS1基因具有β-AS 的功能和活性，能促進異源煙草中β-香樹脂醇的積累。由于煙草有豐富的代謝途徑，能提供的代謝產(chǎn)物種類豐富，不僅能為基因驗證提供前體，通過檢測催化產(chǎn)物驗證基因的功能，還能將煙草作為植物底盤進行次生代謝物的合成。人參皂苷、紫杉醇等三萜化合物的前體已在煙草中成功合成，這為其他三萜化合物以煙草為底盤進行路徑解析及異源合成提供了可能[22-23]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突