李琪琪，王雪嬌，初英杰，劉 霞，禹艷麗，王 遙*，賈 鑫*

1. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100027

2. 北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 100027

冬蟲夏草Cordycepssinensis(Berk.) Sacc.屬于麥角菌科真菌，是我國特有的中草藥，并被用于腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘等癥[1-3]。研究表明，冬蟲夏草具有調血脂、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種藥理學活性。中國被毛孢是冬蟲夏草的無性型菌株，也是其藥理活性成分的主要來源和唯一代表性真菌。

冬蟲夏草對機體的免疫調節(jié)及其藥理功能發(fā)揮具有重要意義。冬蟲夏草可發(fā)揮類似于免疫佐劑的功能，被用于改善移植病變和器官移植患者免疫力低下的輔助治療[4]。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草水提取物具有治療和改善輻射誘導的免疫抑制的功效[5]。此外，冬蟲夏草表現(xiàn)出顯著的抗炎作用，蟲草水提取物通過抑制趨化因子表達，在免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）腎病中發(fā)揮抗炎功能；蟲草水提取物通過抑制細胞凋亡和促炎因子表達，從而減輕肝損傷和肝臟的局部炎癥[6-8]。蟲草多糖和蟲草素是冬蟲夏草（中國被毛孢菌絲體）水提物中的主要藥效成分[9-10]。其中，蟲草多糖可通過抗氧化和調血脂作用，發(fā)揮對非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠的保護作用，并有效緩解博來霉素引起的小鼠肺纖維化[11-16]。蟲草素通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路和抑制信號轉導和轉錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）磷酸化抑制過度炎癥浸潤，從而有效改善非酒精性脂肪肝[17-18]。然而，目前關于冬蟲夏草醇提取物的免疫藥理功能仍鮮有報道，探究其醇提物中的主要成分和免疫藥理作用具有現(xiàn)實意義。本研究利用巨噬細胞和小鼠模型，探究中國被毛孢醇提物（Hirsutellasinensisalcohol extract，HSAE）的免疫調控功能和機制。

1 材料

1.1 細胞

小鼠巨噬細胞RAW264.7 購自美國ATCC。

1.2 動物

SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，體質量18～20 g，6～8 周齡，購自斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于溫度18～22 ℃、濕度50%～60%、12 h 光暗交替的環(huán)境中，自由進食飲水。所有動物實驗和研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號BUCM-2022-041303-2016），并嚴格按照動物實驗相關章程執(zhí)行。

1.3 藥品與試劑

HSAE 凍干粉由云南大學與云南白藥集團股份有限公司提供；去離子水為實驗室Milli-Q（18.2 MΩ）自制超純水、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號C11995500CP）、胎牛血清（批號2358184P）、BCA蛋白定量試劑盒（批號23227）、質譜級乙腈及甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D4540）、20×TBST溶液（批號T1082）、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（批號T1070-500 mL）購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 細胞增殖-毒性檢測試劑盒（批號CK04）購自東仁化學科技（上海）有限公司；Trizol 試劑（批號15596018）購自Invitrogen 公司；Evo M-MLV RT Kit（批號AG11711）、0.25%胰蛋白酶/EDTA 細胞消化液（批號T1300）、SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批號AG11701）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；都氏試劑（批號R22785-100 mL）、綿羊紅細胞（4%，批號R21900-100 mL）、補體（正常豚鼠血清，批號S27068-1 mL*10）、匹多莫德（批號S80183-5 g）購自上海源葉生物科技有限公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（批號PG212）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；超敏ECL 發(fā)光液（批號WBKLS0500）購自美國Millipore 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號60004-1-Ig）購自英國Abcam 公司；c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）抗體（批號9252S）、p-JNK抗體（批號 9251S）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗體（批號9102L）、p-ERK 抗體（批號9106S）、p38 抗體（批號9212S）、p-p38 抗體（批號9211S）購自美國CST 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（批號M21002S）、HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 抗體（批號M21001S）購自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號L4391）購自美國Sigma 公司。

1.4 儀器

CFX96 型熒光定量PCR 儀、T100 型PCR 儀、SCl-VS 型可調式混勻儀（美國Scilogex 公司）；PowerPac 型基礎電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；UPLC-QE-Orbitrap-MS 質譜儀（Xcalibur 質譜工作站）、NANODROP ONEc 型分光光度計、Sorvall?Legend? Micro 21R 型微量離心機、1300 Series A2型生物安全柜、Heracell 150i 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SpectraMax i3x 型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；Mill-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；ZHCH-C1115B型超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；SK-L180-Pro 型數(shù)控線性搖床[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司]；EPS-300 型數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能公司）；CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制

取HSAE 凍干粉100 mg，加入1 mL DMSO 充分振蕩混勻，即為100 μg/μL 母液，分裝后儲存于-80 ℃待用。

2.2 細胞培養(yǎng)

RAW264.7 細胞用含1%青霉素-鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度為90%左右時，按1∶5 的比例進行傳代。

2.3 液質聯(lián)用色譜-質譜分析

2.3.1 樣品溶液的制備 精密稱取HSAE 凍干粉20 mg 于1.5 mL EP 管，加入1 mL 甲醇渦旋溶解，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

2.3.2 液相條件 Waters HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～30 min，5%～95% B。柱溫40 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量2 μL。

2.3.3 質譜條件 離子源為電噴霧電離源（ESI）；正負離子同時掃描；掃描模式為Full scan/dd MS2，掃描范圍m/z100～1500；毛細管溫度350 ℃；正離子模式噴霧電壓3500 V，負離子模式噴霧電壓3000 V；鞘氣35 arb，輔助氣15 arb；標準化碰撞能為35%；一級質譜分辨率為70 000，二級質譜分辨率為17 500。

2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖活性

RAW264.7 細胞以9×104/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)箱中過夜使細胞完全貼壁且細胞密度為80%～90%。用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋HSAE 母液至相應質量濃度（1×10-4、1×10-3、0.01、0.1、1、10、100、1000、1×104μg/mL），將稀釋好的HSAE 溶液加入細胞中，每孔100 μL，同時設置僅加入DMEM 完全培養(yǎng)基（無細胞）的空白組和加入1%DMSO 的溶劑對照組（有細胞），每組設置3 個復孔，于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μL CCK-8 試劑，于培養(yǎng)箱中孵育30 min，待培養(yǎng)基變?yōu)槌赛S色后，酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）值，計算細胞存活率，繪制細胞增殖曲線。

2.5 細胞吞噬活性檢測

RAW264.7 細胞以9×104/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)箱中過夜使細胞完全貼壁且細胞密度為80%～90%。用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋HSAE 母液至相應質量濃度（1×10-4、1×10-3、0.01、0.1、1、10、100、1000、1×104μg/mL），分別用稀釋好的HSAE溶液和LPS（500 ng/mL，陽性對照）處理細胞，每組設置3 個復孔，于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去上清，每孔加入100 μL 1%中性紅溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用PBS 洗滌3 次，每孔加入100 μL 細胞裂解緩沖液（無水乙醇-冰醋酸1∶1），4 ℃靜置過夜，酶標儀測定570 nm 處的A值，計算細胞吞噬活性。

2.6 小鼠體內(nèi)血清溶血素測定實驗

將小鼠分為空白組（PBS）、匹多莫德（100 mg/kg）組和HSAE 低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組，每組5 只。各組小鼠ig 200 μL 相應藥物，1 次/d，連續(xù)21 d；實驗結束前5 d 開始，各組小鼠ip 0.2 mL 綿羊紅細胞致敏，直至實驗結束，小鼠摘眼球取血后脫頸椎處死。血液放置30 min 后經(jīng)離心分離得到血清，將血清與生理鹽水按1∶500 的比例混勻，吸取0.5 mL 稀釋后的血清，與0.25 mL綿羊紅細胞混合，在低溫下加入0.5 mL 豚鼠血清混合。設置不加血清的對照組，37 ℃恒溫箱中孵育30 min，隨后立即移至0 ℃冰箱結束反應，3000 r/min離心5 min，取上清液，酶標儀檢測540 nm 處的A值。將0.25 mL 綿羊紅細胞與3.75 mL 都氏試劑混合后測定A值，代表綿羊紅細胞的半數(shù)溶血值（half value of hemolysin，HC50）。

2.7 qRT-PCR 檢測HSAE 對細胞因子表達的影響

RAW264.7 細胞以4×105/孔接種于24 孔板，過夜培養(yǎng)使其完全貼壁。設置濃度梯度加藥和時間梯度加藥實驗。用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋HSAE母液（100 μg/μL）至相應質量濃度（25、50、100、200 μg/mL），加或不加LPS（500 ng/mL）共同孵育2 h，收集細胞。

用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋HSAE 母液（100 μg/μL）至200 μg/mL，加或不加LPS（500 ng/mL）共同孵育30、60、90 min，收集細胞。按照試劑盒說明書提取細胞總RNA 并合成cDNA，進行qRTPCR 分析。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，Tnf）、CXC 趨化因子配體10（CXC chemokine ligand 10，Cxcl10）和干擾素β1（interferon beta 1，Ifnb1）的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.8 Western blotting 檢測HSAE 對p-p38、p38、p-p65、p65、p-JNK、JNK、p-ERK 和ERK 蛋白表達的影響

RAW264.7 細胞以8×105/孔接種于12 孔板，過夜培養(yǎng)使其完全貼壁。按“2.7”項下方法給藥，過夜培養(yǎng)使其完全貼壁。按“2.7”項下方法給藥，收集細胞，使用IP 裂解液使細胞充分裂解，離心后取上清，加入5×Loading Buffer，100 ℃使蛋白變性，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗，顯影。

2.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，使用單因素方差分析進行組間比較，結果采用±s表示。

3 結果

3.1 HSAE 的成分測定

利用HPLC-MS 技術鑒定分析HSAE 中所含成分，HPLC-MS 基峰圖見圖1?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定腺苷為鑒定冬蟲夏草的主要有效成分[21]，HSAE 所含成分主要包含核苷、氨基酸類以及蟲草酸等。其中腺苷為核苷類的主要成分，但未鑒定出蟲草多糖和蟲草素成分（表2）。蟲草多糖為極性分子，多包含于水提物成分[9-10]；此外，多個團隊也報道冬蟲夏草中不含蟲草素成分[22-27]。

圖1 HSAE 的HPLC-MS 基峰圖Fig. 1 HPLC-MS base peak map of HSAE

表2 HSAE 主要成分及分類Table 2 Main components and classification of HSAE

3.2 HSAE 對巨噬細胞活性的影響

使用CCK-8 法檢測不同質量濃度的HSAE 處理24 h 對RAW264.7 細胞存活率的影響，并繪制量-效關系曲線，計算得到HSAE 對細胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為933.3 μg/mL（圖2）。選取5、50、100、200 μg/mL 4 個質量濃度進行后續(xù)細胞實驗。

圖2 HSAE 對巨噬細胞存活率的影響 (±s, n = 3)Fig. 2 Effect of HSAE on survival rate of macrophages(±s, n = 3)

3.3 HSAE 可以增加巨噬細胞的吞噬能力

巨噬細胞吞噬入侵的病原體并遞呈抗原，分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β 等促炎細胞因子，從而激活招募多種免疫細胞共同抵抗病原體的入侵。巨噬細胞可吞噬中性紅染料，其吞噬能力可通過定量巨噬細胞吞噬中性紅后的吸光度變化所反映。在HSAE 或LPS（陽性對照，LPS 具有激活巨噬細胞吞噬的功能）處理后的細胞中加入中性紅溶液，1 h 后除去，再將細胞裂解，靜置過夜后檢測A值的變化。如圖3 所示，HSAE 處理能夠顯著增加巨噬細胞的吞噬能力，并呈劑量相關性（P＜0.01、0.001），其促進吞噬的作用強于陽性對照LPS處理組。

圖3 HSAE 對巨噬細胞吞噬能力的增強作用 (±s, n = 3)Fig. 3 Enhancement of phagocytosis of macrophages by HSAE (±s, n = 3)

3.4 HSAE 對小鼠臟器指數(shù)和免疫功能的影響

如圖4 所示，各給藥組小鼠腎、脾和胸腺臟器指數(shù)均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），匹多莫德組和HSAE 低劑量組肝臟器指數(shù)顯著升高（P＜0.05、0.01），各給藥組均可增強小鼠的血清溶血素水平。

3.5 HSAE 能激活靜息狀態(tài)下巨噬細胞中免疫因子的表達

促炎細胞因子的分泌對于維持和調節(jié)免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關重要。因此，考察HSAE 單獨刺激時對細胞因子表達的影響，如圖5 所示，與對照組比較，HSAE 誘導Tnf、Cxcl10和Ifnb1基因表達增加（P＜0.01、0.001），且呈劑量和時間相關性，表明HSAE能夠促進靜息巨噬細胞中促炎細胞因子的表達。

圖4 HSAE 對小鼠的抗炎及免疫調節(jié)作用 (±s, n = 5)Fig. 4 Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of HSAE on mice (±s, n = 5)

圖5 HSAE 誘導巨噬細胞中相關細胞因子基因的表達 (±s, n = 3)Fig. 5 HSAE induced cytokine gene expressions in macrophages (±s, n = 3)

3.6 HSAE 能抑制LPS 誘導炎癥激活的巨噬細胞中免疫因子的表達

LPS 是一種常用的細菌內(nèi)毒素，巨噬細胞識別LPS 后，激活細胞信號轉導，轉錄并釋放多種促炎細胞因子，激活炎癥反應。HSAE 與LPS 共處理后，檢測細胞中促炎細胞因子與干擾素的表達，如圖6所示，與單獨LPS 刺激組相比，在RAW264.7 細胞中HSAE 與LPS 共處理后，Tnf、Cxcl10、Ifnb1mRNA表達隨著藥物質量濃度升高而下降（P＜0.05、0.01、0.001），抑制效果呈時間相關性。以上結果表明，HSAE 可以抑制炎癥激活后巨噬細胞中促炎細胞因子和干擾素的mRNA 表達，從而發(fā)揮其抗炎效應。

圖6 HSAE 抑制LPS 誘導的炎癥因子表達 (±s, n = 3)Fig. 6 HSAE inhibited expressions of inflammatory factors induced by LPS (±s, n = 3)

3.7 HSAE 通過調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路介導免疫雙向調控功能

為了探究HSAE 的免疫調控功能的分子機制，采用Western blotting 檢測MAPK 通路關鍵因子JNK、ERK、p38 和NF-κB 通路的重要亞基p65 的磷酸化變化。如圖7-A 所示，靜息狀態(tài)下的RAW264.7 細胞中，隨著HSAE 質量濃度的升高，細胞中p-JNK、p-ERK 和p-p65 的蛋白磷酸化水平相對逐步增強，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05、0.01）；而HSAE 不同時間點處理后，p-JNK、p-ERK 和p-p65 的蛋白磷酸化水平隨時間增加而減弱（圖7-B）。

圖7 HSAE 激活MAPK 通路和NF-κB 通路 (±s, n = 3)Fig. 7 HSAE activated MAPK pathway and NF-κB pathway (±s, n = 3)

如圖7-C 所示，在LPS 誘導的炎癥激活模型中，加入HSAE 處理不同時間，LPS 激活的p-JNK、p-ERK、p-p38 和p-p65 蛋白磷酸化水平逐步抑制，與LPS 刺激組比較差異顯著（P＜0.01、0.001）。以上結果表明，HSAE 的免疫雙向調控與其對MAPK通路和NF-κB 通路的調控密切相關。

4 討論

免疫系統(tǒng)的嚴密調控是維持人體健康的充分必要條件。機體免疫力低下，其免疫應答不足或不及，可造成病原微生物入侵并在宿主體內(nèi)增殖、復制，誘發(fā)病原感染性疾病。此外，宿主免疫識別病原入侵信號后，激活炎癥相關信號通路，誘發(fā)炎癥反應。適度的炎癥反應是機體清除病原微生物的重要方式，然而，當炎癥信號過度或持續(xù)激活，則會導致炎癥性的組織損傷，誘發(fā)機體的系統(tǒng)性病變和腫瘤發(fā)生。因此，探究冬蟲夏草的免疫雙向調控功能及其作用的分子機制，具有重要的科學意義和臨床應用價值。

巨噬細胞是固有免疫中一類重要的抗原遞呈細胞，具有吞噬殺傷病原體和遞呈病原體抗原的作用，其通過分泌多種細胞因子，在調控機體的固有免疫和適應性免疫應答中發(fā)揮著不可或缺的作用[19-20]。病原體感染或組織損傷時，巨噬細胞通過細胞膜上和細胞質中的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別病原體的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），激活MAPK 亞家族的成員，包括ERK、p38 和JNK亞家族以及NF-κB 的磷酸化誘導TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎細胞因子表達，從而發(fā)揮調控固有免疫和適應性免疫的功能。

研究表明，蟲草多糖單獨處理可以誘導巨噬細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 等細胞因子的分泌，增強巨噬細胞的吞噬活性[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSAE 可以促進靜息狀態(tài)下RAW264.7 細胞的吞噬能力，并顯著增加Tnf、Cxcl10等基因的表達。表明HSAE在體外具有明確的免疫激活作用。利用LPS 刺激的巨噬細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)HSAE 顯著下調Tnf、Cxcl10的mRNA 表達水平，并呈劑量和時間相關性。此外，HSAE 單獨處理促進了RAW264.7 巨噬細胞MAPK 和NF-κB 信號通路激活，并在炎癥激活后抑制了MAPK 和NF-κB 信號通路關鍵因子的磷酸化。上述結果與蟲草素的免疫雙向調控功能的報道一致。

本研究首次闡明HSAE 的雙向免疫調控功能，初步發(fā)現(xiàn)該活性可能與其對MAPK 和NF-κB 通路的調控有關，為中國被毛孢的臨床應用和藥理學研究提供了實驗數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突