盧玉潔，周珊珊，單鈺君，徐瑩瑩，程碧欣，朱志紅，鄭杭生

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

全緣千里光堿（integerrimine，INT）是從菊科（Compositae）千里光屬SenecioL.的多年生草本植物峨嵋千里光SeneciofaberiHemsl.中提取的一種雙稠吡咯環(huán)生物堿，能干擾細(xì)胞的有絲分裂而具有抗腫瘤作用，但全身用藥后，對(duì)肝臟產(chǎn)生蓄積性的、不可逆的強(qiáng)烈毒性作用[1]。除了在20 世紀(jì)70 年代國(guó)內(nèi)臨床上小規(guī)模地通過灌注治療膀胱癌[2]外，基本未在臨床推廣使用。徐月紅等[2]與成秉辰[3]的研究證明INT 對(duì)皮膚黑色素瘤有抑制作用，徐月紅等[4]首先提出將INT 制成脂質(zhì)體后皮膚外用用于治療皮膚癌，并申請(qǐng)了專利。脂質(zhì)體包裹的INT 皮膚應(yīng)用后可以提高INT 在皮膚局部角質(zhì)層或表皮類脂內(nèi)的滯留量，延長(zhǎng)滯留時(shí)間，減少全身吸收，從而增強(qiáng)抗皮膚癌的效果，降低全身性毒性。

脂質(zhì)體在皮膚局部用藥與化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用近30 年來受到了人們的廣泛關(guān)注，將脂質(zhì)體分散于水性凝膠基質(zhì)中制成脂質(zhì)體凝膠劑是這類制劑的常見應(yīng)用形式[5-6]。載藥脂質(zhì)體及其凝膠劑的皮膚藥物滯留與滲透行為的考察對(duì)于闡明制劑的經(jīng)皮吸收特性是必不可少的，同時(shí)有助于探討脂質(zhì)體與凝膠的相互作用、制劑皮膚應(yīng)用后增效減毒的特性以及制劑的作用機(jī)制，故本實(shí)驗(yàn)研究了INT 脂質(zhì)體及其凝膠劑的藥物離體皮膚滯留與滲透行為。

1 儀器與材料

LC-2130 型高效液相色譜儀、LC-2030 型紫外檢測(cè)器，上海天美科學(xué)儀器有限公司；TT-8D 型藥物透皮吸收儀，天津市正通科技有限公司；T-25 型高剪切分散儀，德國(guó)易卡公司；Emulsi Flex-C5 型高壓均質(zhì)機(jī)，加拿大Avestin 公司；Nicomp 380 CLS型激光散射粒度測(cè)定儀，美國(guó)Pss 公司；BX51 型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；透明膠帶，北京市鑫田黎明醫(yī)療器械有限公司；TDL-80-2S 型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；H-600 型透射電子顯微鏡（TEM），日本HITACHI 株式會(huì)社。

INT 原料藥，由上海植華生物工程有限公司從峨眉千里光中提取并純化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%；INT 化學(xué)對(duì)照品，自制，由INT 原料藥經(jīng)重結(jié)晶而得，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98.0%；Carbopol 934P NF，美國(guó)Goodrich公司，批號(hào)cc24HBB151；三乙醇胺、尼泊金乙酯、氯仿、氨水、NaCl，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素E，1012 IU，西格瑪奧德里奇公司；乙腈，HPLC 級(jí)，德國(guó)Merck 公司；甘油，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；膽固醇，注射級(jí)，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；大豆磷脂，注射級(jí)，磷脂酰膽堿含量大于70%，上海太偉藥業(yè)有限公司；pH 4.0 檸檬酸緩沖液（CBS 4.0），將0.1 mol/L 檸檬酸溶液與0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液按62∶38 的比例混合配成。HPLC 用水為雙蒸水。

新西蘭大白兔，雄性，體質(zhì)量（2.5±0.2）kg，清潔級(jí)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［合格證號(hào)SCXK（滬）2013-0016］。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備與表征

進(jìn)行離體皮膚滲透與滯留考察的樣品包括：INT 脂質(zhì)體、INT 脂質(zhì)體凝膠劑與INT 普通凝膠劑。

2.1.1 INT 脂質(zhì)體的制備與表征 按前期研究所得的優(yōu)化處方與制法[7]制備優(yōu)化處方脂質(zhì)體樣品。

處方：按制備1000 g 脂質(zhì)體混懸液成品計(jì)，INT 20.5 g、大豆磷脂60.0 g、膽固醇15.0 g、維生素E 3.0 g、CBS 4.0 900 mL、1 mol/L NaOH 水溶液適量。

制法：將INT、大豆磷脂、膽固醇、維生素E溶于1500 mL CHCl3，置于20 L 圓底燒瓶中，50 r/min、60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去CHCl3，在圓底燒瓶瓶壁上形成一層干膜，室溫下真空干燥1 d 以除去殘余CHCl3，加入處方量CBS 4.0 進(jìn)行水化，首先振搖使瓶壁上的膜溶散，接著冰箱4 ℃放置8～10 h，最后以高剪切分散儀進(jìn)行分散（間歇剪切10 次，每次持續(xù)時(shí)150 s），即得均勻分散的脂質(zhì)體混懸液（其pH 值在5.29 左右）。

通過調(diào)節(jié)外水相pH 值，可以利用內(nèi)、外相pH值梯度將INT 主動(dòng)導(dǎo)入內(nèi)水相，即為pH 值梯度載藥。在室溫、磁力攪拌下，以1 mol/mL NaOH 水溶液適量調(diào)節(jié)混懸液的pH 值，即得pH 值梯度載藥優(yōu)化脂質(zhì)體成品，充氮?dú)夂? ℃保存，備用。

為了考察脂質(zhì)體理化參數(shù)對(duì)其中包載藥物的皮膚滲透與滯留的影響，對(duì)優(yōu)化處方與制法按需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，制備如下4 份樣品：按優(yōu)化處方制備脂質(zhì)體混懸液，但未進(jìn)行pH 值梯度載藥，所得樣品pH 值較低，包封率較低，且囊泡粒徑較大，記為1 號(hào)樣；按優(yōu)化處方制備的脂質(zhì)體混懸液，為了便于比較，與本實(shí)驗(yàn)其他考察樣品平行制備，所得樣品pH 值較高，包封率較高，且囊泡粒徑較大，記為2 號(hào)樣；按優(yōu)化處方制備脂質(zhì)體混懸液，但未進(jìn)行pH 值梯度載藥，并進(jìn)行高壓均質(zhì)（均質(zhì)次數(shù)為8 次，最大壓力為14 MPa）使粒徑減小，所得樣品pH 值較低，包封率較低，且囊泡粒徑較小，記為3 號(hào)樣；對(duì)3 號(hào)樣的制法進(jìn)行調(diào)整，增加pH 值梯度載藥步驟（提高2 個(gè)單位的pH 值），所得樣品pH 值較高，包封率較3 號(hào)樣高，且囊泡粒徑較小，記為4 號(hào)樣。

采用激光散射粒度測(cè)定儀測(cè)定上述4 份樣品的粒徑、ζ 電位，按前期研究中建立的方法進(jìn)行藥物含量與包封率的測(cè)定[8]，結(jié)果見表1。樣品1 測(cè)得粒徑為（349.9±198.0）nm，包封率為12.53%，經(jīng)過高壓均質(zhì)后的樣品3 粒徑明顯縮小，包封率也相對(duì)減小，而采用pH 值梯度載藥制備的樣品2，粒徑為（281.0±49.6）nm，包封率為57.75%，遠(yuǎn)高于樣品1 和樣品3。樣品4 采用了pH 值梯度載藥法并經(jīng)過高壓均質(zhì)，有部分結(jié)晶出現(xiàn)，因此，未進(jìn)行包封率測(cè)定。

表1 4 份不同脂質(zhì)體樣品的理化性質(zhì) (±s, n = 3)Table 1 Physicochemical parameters of four different liposome samples (±s, n = 3)

表1 4 份不同脂質(zhì)體樣品的理化性質(zhì) (±s, n = 3)Table 1 Physicochemical parameters of four different liposome samples (±s, n = 3)

“-”由于脂質(zhì)體樣品中存在INT 結(jié)晶，未進(jìn)行包封率測(cè)定“-” the EE determination wasn’t conducted because of the presence of INT crystal in the liposome sample

樣品號(hào) 平均粒徑/nm ζ 電位/mV 樣品形態(tài) INT/(mg·g-1) 包封率/%1 349.9±198.0 1.03 近球形，單、多層共存 19.51 12.53 2 281.0±49.6 1.09 近球形，單、多層共存 18.88 57.75 3 106.1±47.0 0.07 近球形，單層 18.19 7.77 4 118.1±49.3 1.75 近球形，單層，結(jié)晶 17.19 -

取少量樣品滴于銅網(wǎng)正面，多余樣品液用濾紙吸去，滴加少許2%磷鎢酸溶液后負(fù)染2 min，用濾紙吸去多余染液，自然晾干后，在TEM 下觀察并拍攝照片。同時(shí)，將少量樣品滴于載玻片上，蓋上載玻片，用濾紙吸去多余液體，放置在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝照片。TEM 與顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，結(jié)果見圖1、2。TEM 結(jié)果表明，脂質(zhì)體為類圓形，大小及分布較均勻，顆粒間未有明顯的粘連現(xiàn)象。光學(xué)顯微鏡結(jié)果可以觀察到，脂質(zhì)體多層的結(jié)構(gòu)。對(duì)比3 個(gè)樣品，可以看出，高壓均質(zhì)后脂質(zhì)體的粒徑明顯減小，大粒徑脂質(zhì)體pH 值調(diào)節(jié)前后的形態(tài)無顯著變化，小粒徑脂質(zhì)體pH 值調(diào)高后有藥物結(jié)晶析出，在光學(xué)顯微鏡下即可觀察到明顯結(jié)晶，因此，未進(jìn)行TEM 拍攝。

圖1 用于離體皮膚滲透試驗(yàn)的脂質(zhì)體樣品1 (A)、2 (B)、3 (C) 的透射電鏡圖Fig. 1 TEM images of liposome samples 1 (A), 2 (B), 3 (C) for ex vivo skin permeation test

圖2 用于離體皮膚滲透試驗(yàn)的脂質(zhì)體樣品1 (A)、2 (B)、3 (C) 與4 (D) 的顯微鏡照片 (×400)Fig. 2 Microscopic pictures of liposome samples 1 (A), 2 (B), 3 (C) and 4 (D) for ex vivo skin permeation tests (× 400)

2.1.2 INT 脂質(zhì)體凝膠劑的制備 取優(yōu)化處方制備的脂質(zhì)體混懸液，按前期研究所得的處方與制法[7]進(jìn)行制備。按制備1000 g 脂質(zhì)體凝膠劑成品計(jì)，脂質(zhì)體混懸液589.3 g、Carbopol 934P 15.0 g、甘油90.0 g、蒸餾水304.5 mL、尼泊金乙酯1.2 g、三乙醇胺適量。取處方量的尼泊金乙酯，加熱溶于處方量的蒸餾水中；取處方量的Carbopol 934P，加入甘油潤(rùn)濕，加入溶有尼泊金乙酯的蒸餾水，攪拌均勻，即得INT 脂質(zhì)體凝膠放置數(shù)小時(shí)，使Carbopol 934P溶脹呈透明均質(zhì)狀態(tài)，慢慢加入脂質(zhì)體混懸液，邊加邊攪拌，至均勻，以適量三乙醇胺調(diào)節(jié)至合適稠度，即得。成品凝膠劑中囊泡分散良好，無聚集；與未加入凝膠的脂質(zhì)體相比，凝膠中的脂質(zhì)體圓整度降低、多層脂質(zhì)體略變少、粒徑略減小。測(cè)得INT質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.19 mg/g 的凝膠[7]。

2.1.3 INT 普通凝膠劑的制備及其中INT 含量的測(cè)定 按前期研究所得的處方與制法進(jìn)行制備[9]，經(jīng)含量測(cè)定，凝膠劑中INT 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.31 mg/g的凝膠。

2.2 滲透試驗(yàn)接收液中藥物INT 的HPLC 測(cè)定

2.2.1 色譜條件 參照宋華等[10]建立的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為X Terra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters）；流動(dòng)相為水-乙腈（70∶30），每1000 毫升流動(dòng)相中加入冰醋酸1 mL，以氨水將pH 值調(diào)至8.6；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)213 nm；柱溫為室溫。在此條件下，理論塔板數(shù)以INT色譜峰計(jì)不低于3000。

2.2.2 線性關(guān)系考察 以空白滲透試驗(yàn)接收液配制系列質(zhì)量濃度INT 對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，將INT 的峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A＝52 771C＋3310（r＝0.999 9，n＝5），可見，INT 在0.499～9.970 μg/mL 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的INT 對(duì)照品溶液，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，低、中、高質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度分別為1.9%、2.1%、1.5%（n＝5），日間精密度分別為2.2%、2.3%、1.7%（n＝3），符合要求。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 以空白滲透試驗(yàn)接收液配制低、中、高質(zhì)量濃度的INT 對(duì)照品溶液，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果分別為（101.1±1.3）%、（101.3±1.0）%、（100.6±0.9）%，符合要求。

2.2.5 重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn) 取12 h的離體皮膚滲透試驗(yàn)接收液，在0 時(shí)間點(diǎn)按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算RSD，結(jié)果為0.8%，說明重復(fù)性良好；進(jìn)而分別在1、2、4、8、12 h 進(jìn)樣分析，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的RSD，結(jié)果為1.2%，說明接收液中的INT 在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 色譜峰的專屬性 對(duì)照空白接收液、含藥滲透試驗(yàn)接收液與對(duì)照品溶液的色譜圖表明，空白接收液對(duì)測(cè)定無干擾，方法專屬性符合要求。

2.3 皮膚中滯留藥物的HPLC 測(cè)定

2.3.1 色譜條件 參照陳思思等[11]建立的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。除將流動(dòng)相改為乙睛-水（23∶77），并用氨水調(diào)節(jié)其pH 值為7.1 之外，其余同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.3.2 皮膚樣品的預(yù)處理與HPLC 分析 取待測(cè)皮膚樣品，置于13 mm×65 mm 的有柄研磨器中，加入2 mL 氨水作為研磨介質(zhì)進(jìn)行研磨，直至將皮膚磨成均勻的漿狀，再加入1 mL 氨水，渦旋混合15 s，用醋酸乙酯提取3 次，各次醋酸乙酯的用量分別為3、2、2 mL，每次提取渦旋30 s、2500 r/min 離心5 min，合并各次醋酸乙酯提取液，氮?dú)獯蹈?，以乙?水（1∶1）混合液200 μL 溶解殘?jiān)?，吸?0 μL 進(jìn)樣進(jìn)行HPLC 分析。

2.3.3 色譜峰的專屬性 取離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)中藥物應(yīng)用720 min 后的皮膚半塊、等面積空白皮膚、等面積空白皮膚加一定量的INT 對(duì)照品溶液，分別按上述方法進(jìn)行樣品預(yù)處理與HPLC 分析，色譜圖見圖3-A～C，由圖可見，INT 的出峰時(shí)間在10.7 min，皮膚中的內(nèi)源性成分對(duì)INT 的含量測(cè)定無干擾，方法專屬性符合要求。

圖3 HPLC 測(cè)定皮膚中INT 的色譜峰專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig. 3 Chromatographic peak specificity test chromatograms for determination of INT in skin by HPLC

2.3.4 線性關(guān)系考察 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積的一定質(zhì)量濃度INT 對(duì)照品水溶液（其中INT 總藥量依次為0.525、2.100、4.200、10.500、15.750、21.000、31.500 μg）。按上述方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理與HPLC 分析，進(jìn)樣后記錄INT 對(duì)應(yīng)的峰面積（A），將峰面積對(duì)INT 總量（m）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A＝203 992m－24 120（r＝0.999 8，n＝7），可見，INT 在0.525～31.500 μg 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。另外，經(jīng)測(cè)定本法的最低檢測(cè)限為0.05 μg（S/N≥3）。

2.3.5 回收率、精密度與提取回收率試驗(yàn) 取空白皮膚1 cm2，加入不同體積的一定質(zhì)量濃度INT 對(duì)照品水溶液（其中INT 總藥量依次為0.525、4.200、31.500 μg）。按“2.3.2”項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，并按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行HPLC 分析，記錄INT對(duì)應(yīng)的峰面積，各個(gè)加藥量的空白皮膚樣品分別在1 d 內(nèi)連續(xù)測(cè)定5 份，求得日內(nèi)精密度，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相對(duì)回收率，各個(gè)加藥量的空白皮膚樣品分別在5 d 各測(cè)1 份，求得日間精密度，結(jié)果見表2。可見，方法精密度與準(zhǔn)確性良好。

表2 日內(nèi)、日間精密度與相對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n = 5)Table 2 Within-day and inter-day precision and relative recovery (n = 5)

另將INT 對(duì)照品水溶液直接進(jìn)樣，測(cè)得相應(yīng)峰面積，以此為參照，計(jì)算空白皮膚中3 種不同加藥量（分別為0.525、4.200、31.500 μg）樣品的提取回收率分別為79.97%、82.09%、78.48%，平均值為80.18%，符合生物樣本含量測(cè)定中對(duì)提取回收率的要求。

2.4 離體皮膚的制備

取健康新西蘭大白兔（體質(zhì)量2.5～3.0 kg），剪去耳背部的毛。以過量乙醚麻醉致死后，取下耳背部的皮膚，除去皮下組織，洗凈，在生理鹽水中浸泡后展平，夾在兩玻璃板間，塑料袋密封包裝后置于冰箱低溫保存，備用。

2.5 離體皮膚滲透

2.5.1 實(shí)驗(yàn)過程 采用Franz 擴(kuò)散池進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[12]。取冰凍兔耳耳背皮膚，室溫放置解凍，剪取合適大小（約1.4 cm×1.4 cm）的正方形皮膚樣品，適當(dāng)拉力下展平，固定于供給池與接收池的磨口對(duì)接處，角質(zhì)層面向供給池，有效滲透面積為0.785 cm2（按擴(kuò)散池內(nèi)口直徑1.00 cm 計(jì)算得到）。

分別將成品INT 脂質(zhì)體凝膠劑0.25 g、優(yōu)化脂質(zhì)體混懸液0.15 g 與INT 普通凝膠劑0.25 g 均勻地涂布于皮膚角質(zhì)層上，實(shí)驗(yàn)中供給池保持非封閉狀態(tài)。接收池中加入6.0 mL 生理鹽水（用煮沸適當(dāng)時(shí)間放冷后的蒸餾水配制）作為接收液，37 ℃恒溫水浴浸沒接收池，400 r/min 定速攪拌接收液，于15、30、60、120、180、240、360、480、600、720 min從接收液中取樣0.25 mL，同時(shí)向接收池中補(bǔ)加等量同溫的生理鹽水。

從所取樣品液中吸取20 μL 進(jìn)樣，HPLC 測(cè)定其中藥物濃度?？紤]取樣藥物損失，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積藥物透過量，將透過量對(duì)時(shí)間作圖，由透過量曲線后段的直線部分求算藥物穩(wěn)態(tài)滲透速率。每個(gè)樣品平行測(cè)定4 份。不同理化參數(shù)的4 份脂質(zhì)體樣品同上法測(cè)定，投藥量均為0.15 g。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同樣品中INT 透過皮膚的穩(wěn)態(tài)滲透速率見表3，由于所有樣品中藥物滲透速率均較小，因此測(cè)量值的相對(duì)誤差均較大，再加上皮膚本身的差異，所以表中的數(shù)據(jù)波動(dòng)較大。從表中可以看出，這些樣品總的特征是透過量小，其中脂質(zhì)體凝膠劑的穩(wěn)態(tài)滲透速率為（1.863±1.668）μg/(h·cm2)，證明它具有減毒的特性。

表3 不同樣品中INT 的穩(wěn)態(tài)滲透速率 (±s, n = 4)Table 3 Steady state permeation rate of INT in different samples (±s, n = 4)

表3 不同樣品中INT 的穩(wěn)態(tài)滲透速率 (±s, n = 4)Table 3 Steady state permeation rate of INT in different samples (±s, n = 4)

樣品名稱 穩(wěn)態(tài)滲透速率/(μg·h-1·cm-2)脂質(zhì)體凝膠劑 1.863±1.668優(yōu)化脂質(zhì)體 12.753±15.504普通凝膠劑 0.340±0.388脂質(zhì)體樣品1 0.825±0.591脂質(zhì)體樣品2 9.994±10.204脂質(zhì)體樣品3 4.689±4.380脂質(zhì)體樣品4 6.504±3.143

比較表3 中的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)態(tài)滲透速率上存在大小關(guān)系如下：優(yōu)化脂質(zhì)體＞脂質(zhì)體凝膠劑＞普通凝膠劑［經(jīng)方差分析，F(xiàn)＝2.26＜F1-0.05(2,9)＝4.26，無顯著性差異］；不同理化參數(shù)的脂質(zhì)體的透過速率之間的大小關(guān)系如下：樣品2＞樣品4＞樣品3＞樣品1［經(jīng)方差分析，F(xiàn)＝1.75＜F1-0.05(3,12)＝3.49，無顯著性差異］。

2.6 離體皮膚滯留

2.6.1 實(shí)驗(yàn)過程 同“2.5.1”項(xiàng)下操作，720 min 后從擴(kuò)散池之間取下皮膚，將皮膚表面殘存的藥物用水清洗掉，用吸水紙吸干皮膚表面。將皮膚展平于玻璃板上，將有效擴(kuò)散皮膚部分切成同樣大小的兩半，其中一半用透明膠帶在角質(zhì)層側(cè)粘貼并剝離30次以去除皮膚的角質(zhì)層[15]，將兩半皮膚分別按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定INT 含量。每個(gè)樣品平行測(cè)定4 份。

2.6.2 不同樣品中INT 的皮膚滯留 不同樣品應(yīng)用后皮膚中INT 的滯留量測(cè)定結(jié)果見表4，去角質(zhì)層的皮膚中的滯留量測(cè)定結(jié)果見表5，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，進(jìn)一步求得角質(zhì)層藥物滯留量占全皮中藥物滯留量的百分比，結(jié)果見表6。

表4 不同樣品應(yīng)用12 h 后全皮膚中INT 的滯留量 (±s,n = 4)Table 4 Deposited amount of INT in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

表4 不同樣品應(yīng)用12 h 后全皮膚中INT 的滯留量 (±s,n = 4)Table 4 Deposited amount of INT in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

與優(yōu)化脂質(zhì)體比較：*P＜0.05 ****P＜0.000 1；與脂質(zhì)體樣品1 比較：##P＜0.01*P ＜ 0.05 ****P ＜ 0.000 1 vs optimized liposome; ##P ＜ 0.01 vs liposome sample 1

樣品名稱 滯留量/(μg·cm-2)脂質(zhì)體凝膠劑 35.99±8.35*優(yōu)化脂質(zhì)體 53.35±8.88普通凝膠劑 20.61±5.06****脂質(zhì)體樣品1 33.50±9.03脂質(zhì)體樣品2 58.40±9.35##脂質(zhì)體樣品3 47.56±8.08脂質(zhì)體樣品4 49.05±8.52

表5 不同樣品應(yīng)用12 h 后角質(zhì)層下皮膚中INT 的滯留量(±s, n = 4)Table 5 Deposited amount of INT in skin beneath stratum corneum 12 h after application of different samples (±s,n = 4)

表5 不同樣品應(yīng)用12 h 后角質(zhì)層下皮膚中INT 的滯留量(±s, n = 4)Table 5 Deposited amount of INT in skin beneath stratum corneum 12 h after application of different samples (±s,n = 4)

與優(yōu)化脂質(zhì)體比較：**P＜0.01**P ＜ 0.01 vs optimized liposomes

樣品名稱 滯留量/(μg·cm-2)脂質(zhì)體凝膠劑 14.373±3.079優(yōu)化脂質(zhì)體 21.146±5.066普通凝膠劑 8.334±2.915**脂質(zhì)體樣品1 12.766±4.412脂質(zhì)體樣品2 19.580±3.990脂質(zhì)體樣品3 16.102±5.402脂質(zhì)體樣品4 15.770±3.714

表6 不同樣品應(yīng)用12 h 后在角質(zhì)層中INT 的滯留量占全皮的百分比 (±s, n = 4)Table 6 Percentage of deposited amount of INT in stratum corneum to that in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

表6 不同樣品應(yīng)用12 h 后在角質(zhì)層中INT 的滯留量占全皮的百分比 (±s, n = 4)Table 6 Percentage of deposited amount of INT in stratum corneum to that in whole skin 12 h after application of different samples (±s, n = 4)

樣品名稱 占比/%脂質(zhì)體凝膠劑 59.37±6.99優(yōu)化脂質(zhì)體 58.87±15.90普通凝膠劑 60.45±6.84脂質(zhì)體樣品1 61.32±13.27脂質(zhì)體樣品2 66.11±7.46脂質(zhì)體樣品3 66.80±5.73脂質(zhì)體樣品4 67.85±5.46

由表4 可以看出，不同制劑應(yīng)用12 h 后皮膚中滯留量的大小關(guān)系如下：優(yōu)化脂質(zhì)體混懸液＞脂質(zhì)體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.59∶1.75∶1）。對(duì)表4 中制劑①脂質(zhì)體凝膠劑、制劑②優(yōu)化脂質(zhì)體混懸液與制劑③普通凝膠劑應(yīng)用后皮膚中藥物滯留量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同制劑對(duì)藥物皮膚滯留量有極顯著的影響［F＝18.48＞F1-0.01(2,9)＝8.02］。兩兩間多重比較的結(jié)果表明，制劑②與③之間有極顯著性差異（P＜0.000 1，q1-0.01＝5.43），①與②之間有顯著性差異（P＜0.05，q1-0.05＝3.95），①與③之間無顯著性差異。另外，對(duì)表4 中脂質(zhì)體樣品1～4 應(yīng)用12 h 后皮膚中的藥物滯留量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，脂質(zhì)體理化參數(shù)不同對(duì)藥物皮膚滯留量有顯著的影響［F＝5.51＞F1-0.05(3,12)＝3.49］。兩兩間多重比較的結(jié)果表明，樣品1 與2 之間有極顯著性差異（P＜0.01，q1-0.01＝5.50），其余兩兩之間均無顯著性差異（P＞0.05，q1-0.05＝4.20）。樣品2 為經(jīng)過pH 值主動(dòng)載藥的大粒徑脂質(zhì)體，包封率最高，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明高包封率脂質(zhì)體有利于INT 的皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)。

從表5 可以看出，不同制劑皮膚應(yīng)用12 h 后，在角質(zhì)層下皮膚中的滯留量的大小關(guān)系如下：優(yōu)化脂質(zhì)體混懸液＞脂質(zhì)體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.54∶1.72∶1）。對(duì)表5 中制劑①脂質(zhì)體凝膠劑、制劑②優(yōu)化脂質(zhì)體混懸液與制劑③普通凝膠劑應(yīng)用12 h 后角質(zhì)層下皮膚中的藥物滯留量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同制劑對(duì)角質(zhì)層以下皮膚中藥物滯留量有極顯著的影響［F＝11.30＞F1-0.01(2,9)＝8.02］。兩兩間多重比較的結(jié)果表明，制劑①與②，①與③之間均無顯著性差異（P＞0.05，q1-0.05＝3.95）；②與③之間有極顯著性差異（P＜0.01，q1-0.01＝5.43）。對(duì)比表4 與表5 中還可以看出，3 種制劑應(yīng)用后在角質(zhì)層下皮膚中的滯留量的大小比例關(guān)系與在全皮中滯留量的大小比例關(guān)系基本一致。

對(duì)表6 中制劑①脂質(zhì)體凝膠劑、制劑②優(yōu)化脂質(zhì)體混懸液與制劑③普通凝膠劑應(yīng)用12 h后角質(zhì)層藥物滯留量占全皮中藥物滯留量的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同制劑對(duì)角質(zhì)層藥物滯留量占全皮中的百分比均無顯著性影響［F＝0.024＜＜F1-0.05(2,9)＝4.26］。占比均在60%左右，表明進(jìn)入皮膚的藥物在角質(zhì)層中的分布較下層皮膚多一些。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種皮膚中INT 含量測(cè)定的HPLC 方法，該法準(zhǔn)確，精密。測(cè)定中皮膚前處理采用物理研磨法進(jìn)行皮膚勻漿，而未使用強(qiáng)烈腐蝕性的化學(xué)物質(zhì)（如高氯酸[13]等），有利于待測(cè)成分的穩(wěn)定。多數(shù)報(bào)道表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中家兔皮膚的滲透性最大，故很難作為藥物人體透皮吸收預(yù)測(cè)的模型，而正是由于吸收快的性質(zhì)，家兔可以用來指示藥物的皮膚毒性[14]。故本實(shí)驗(yàn)采用家兔皮膚作為滲透試驗(yàn)皮膚。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道[15]用硫化鈉溶液處理皮膚以脫去皮膚上的毛，但硫化鈉可能對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，故本實(shí)驗(yàn)未采用。

離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，普通凝膠劑、脂質(zhì)體與脂質(zhì)體凝膠劑的皮膚透過量均較小，透過速率上大小關(guān)系為優(yōu)化脂質(zhì)體＞脂質(zhì)體凝膠劑＞普通凝膠劑；不同理化參數(shù)的脂質(zhì)體的透過速率之間的大小關(guān)系為pH 值梯度載藥的大粒徑脂質(zhì)體＞pH值梯度載藥的小粒徑脂質(zhì)體＞未經(jīng)pH 值梯度載藥的小粒徑脂質(zhì)體＞未經(jīng)pH 值梯度載藥的大粒徑脂質(zhì)體。

由此可以推測(cè)，脂質(zhì)體對(duì)藥物透過皮膚的轉(zhuǎn)運(yùn)有一定促進(jìn)作用，而這種作用的前提是脂質(zhì)體與皮膚直接接觸，故脂質(zhì)體混懸液的藥物滲透速率最大，脂質(zhì)體凝膠劑中由于凝膠限制了脂質(zhì)體與皮膚的相互作用，所以藥物轉(zhuǎn)運(yùn)速率明顯下降，而普通凝膠劑缺乏這種作用，故藥物滲透速率最小。按照透析袋中釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，凝膠劑與脂質(zhì)體凝膠劑藥物釋放較快，可以推測(cè)，兩者應(yīng)用于皮膚后可以在皮膚表面產(chǎn)生較高的游離藥物濃度，而脂質(zhì)體混懸液在皮膚表面產(chǎn)生的游離藥物濃度較低[9]，然而，離體皮膚滲透的結(jié)果卻表明前兩者藥物皮膚滲透速率較脂質(zhì)體混懸液明顯低，由此進(jìn)一步證明了脂質(zhì)體對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)作用。

關(guān)于脂質(zhì)體促進(jìn)藥物皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)有如下4 種可能的機(jī)制[16-27]。第一，通過脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層與皮膚脂質(zhì)融合直接將脂質(zhì)雙分子層中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到皮膚，第二，藥物由脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層分配到皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)，第三，脂質(zhì)體擾亂皮膚角質(zhì)層中的脂質(zhì)的有序排列使游離藥物的皮膚滲透增加，第四，脂質(zhì)體以整體的形式進(jìn)入皮膚來實(shí)現(xiàn)藥物的皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)。大量的研究[17-18,20,25-26]已將第4 種機(jī)制否定，即，膠態(tài)脂質(zhì)體不能進(jìn)入完整的皮膚。對(duì)照優(yōu)化脂質(zhì)體、脂質(zhì)體凝膠劑、普通凝膠劑的皮膚滲透速率，不能對(duì)INT 脂質(zhì)體促進(jìn)藥物皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制作出明確的推測(cè)，可能是前3 種機(jī)制兼有或其中某1 種或2 種。對(duì)比不同理化參數(shù)的脂質(zhì)體的透過速率可以看出，進(jìn)行pH 值梯度載藥的脂質(zhì)體的透過速率較大，其中大粒徑的脂質(zhì)體較小粒徑的脂質(zhì)體透過速率大。因?yàn)樘岣咄馑鄍H 值之后，藥物包封率提高；大粒徑脂質(zhì)體因?yàn)榘怏w積大，所以包封率高，這2 點(diǎn)都有利于增加通過脂質(zhì)體與皮膚相互作用提高的藥物進(jìn)入皮膚的量，這一結(jié)果進(jìn)一步支持了脂質(zhì)體促進(jìn)藥物皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)論，同時(shí)可以探明其機(jī)制主要為前2 種，因?yàn)槿绻堑? 種機(jī)制，藥物皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)量與脂質(zhì)體的藥物包封率不會(huì)有很大關(guān)系。

由表4 可知，不同制劑應(yīng)用12 h 以后皮膚藥物滯留量的大小關(guān)系如下：優(yōu)化脂質(zhì)體＞脂質(zhì)體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.59∶1.75∶1）。由此推斷，通過脂質(zhì)體與皮膚的相互作用可以促進(jìn)藥物進(jìn)入皮膚，然而，凝膠在一定程度上阻礙脂質(zhì)體與皮膚的相互作用的發(fā)生，從而減小了脂質(zhì)體促進(jìn)藥物進(jìn)入皮膚的作用。但是，從實(shí)際制劑應(yīng)用的方便和制劑的穩(wěn)定性方面考慮，脂質(zhì)體凝膠劑是有利的。使用體溫溶膠化的凝膠或者觸變膠有望將單純脂質(zhì)體在皮膚滯留方面的優(yōu)勢(shì)與脂質(zhì)體凝膠劑在應(yīng)用方便、提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性等方面的優(yōu)勢(shì)集中在一起。

由表5 可知，不同制劑皮膚應(yīng)用12 h 后，在角質(zhì)層以下皮膚中的滯留量的大小關(guān)系如下：優(yōu)化脂質(zhì)體＞脂質(zhì)體凝膠劑＞普通凝膠劑（2.54∶1.72∶1）。3 種制劑應(yīng)用后在角質(zhì)層以下皮膚中的滯留量的大小比例關(guān)系與在全皮中滯留量的大小比例關(guān)系基本一致，并且，角質(zhì)層藥物滯留量占全皮中藥物滯留量的百分?jǐn)?shù)無顯著差異，均在60%左右，由此推斷，脂質(zhì)體的皮膚藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是角質(zhì)層與脂質(zhì)體的脂質(zhì)之間直接分配，而不是脂質(zhì)融合，因?yàn)槿绻腥诤蠙C(jī)制存在，脂質(zhì)體應(yīng)用后的皮膚角質(zhì)層的藥物濃度會(huì)顯著增大，上述比例關(guān)系的一致性就不大可能了。因此，脂質(zhì)體與皮膚的相互作用僅局限于皮膚的角質(zhì)層的表面，進(jìn)入角質(zhì)層的藥物向皮膚更深層次的轉(zhuǎn)運(yùn)完全與藥物自身的性質(zhì)有關(guān)，而與脂質(zhì)體無關(guān)。此外，對(duì)表5 中脂質(zhì)體樣品1～4 應(yīng)用12 h 以后角質(zhì)層以下皮膚中的藥物滯留量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，脂質(zhì)體理化參數(shù)不同對(duì)角質(zhì)層以下皮膚藥物滯留量無顯著性的影響［F＝1.59＜＜F1-0.05(3,12)＝3.49］。按上述進(jìn)入角質(zhì)層的藥物向皮膚更深層轉(zhuǎn)運(yùn)為自主過程，僅與藥物本身性質(zhì)有關(guān)，所以根據(jù)不同理化性質(zhì)的脂質(zhì)體應(yīng)用后在全皮中的滯留量不同，可以推斷在角質(zhì)層下皮膚中的滯留量也是不同，但是由于這一層中藥物滯留量較小，所以統(tǒng)計(jì)結(jié)果未顯現(xiàn)顯著性差異。

樣品2 為經(jīng)過pH 值主動(dòng)載藥的大粒徑脂質(zhì)體，包封率最高，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明這種脂質(zhì)體最有利于INT 的皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)。前面已有推斷，脂質(zhì)體與皮膚之間的直接藥物分配是INT 脂質(zhì)體促進(jìn)藥物進(jìn)入皮膚的機(jī)制，包封率高的脂質(zhì)體可以將更多的藥物運(yùn)送到角質(zhì)層也支持了這一推斷。其他，1 號(hào)樣為未進(jìn)行pH 值梯度載藥的大粒徑脂質(zhì)體，由于包封率低，皮膚藥物滯留量明顯較少；3 號(hào)樣為未進(jìn)行pH值梯度載藥的小粒徑脂質(zhì)體，包封率也較低，但其皮膚滯留量較1 號(hào)樣有所增加，這可能是因?yàn)樾×街|(zhì)體在促進(jìn)藥物進(jìn)入皮膚方面存在著其他的機(jī)制（如通過毛囊轉(zhuǎn)運(yùn)）；4 號(hào)樣為經(jīng)過pH 值梯度載藥的小粒徑脂質(zhì)體，由于包封容積小，有藥物結(jié)晶存在，該樣品產(chǎn)生相對(duì)較高的皮膚滯留量一方面可能是因?yàn)閱为?dú)脂質(zhì)體上載藥量較高（脂質(zhì)體內(nèi)、外水相藥物濃度均已達(dá)到飽和），另一方面可能也是由于其他機(jī)制的存在。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突