祝小婷, 黃佳琳, 林曉宇, 蘇紀(jì)平

水楊酸是阿司匹林的活性成分,具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎等多種功效,是目前全球應(yīng)用最廣泛的非甾體類藥物之一。然而,在水楊酸類藥物使用過程中常伴隨著不少的副作用,尤以耳毒性最為常見,主要表現(xiàn)為耳鳴和聽力下降[1]。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons,SGN)是連接毛細(xì)胞與聽覺中樞的重要樞紐,已被證實(shí)是水楊酸鈉(sodium salicylate,SS)耳毒性的重要作用位點(diǎn)[2],但其具體作用機(jī)制仍未完全明了。氧化應(yīng)激是耳聾的常見損傷機(jī)制,在噪聲性聾[3]、老年性聾[4]以及順鉑誘導(dǎo)的耳毒性聾[5]中均可觀察到氧化應(yīng)激增強(qiáng)。有研究顯示SS對(duì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[6-7]。但亦有研究發(fā)現(xiàn)SS會(huì)增強(qiáng)氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),SS使SGN中過氧化物陰離子[活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)來源之一]水平升高[9],提示SS可能通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致SGN損傷。本研究旨在通過免疫熒光技術(shù)觀察SS對(duì)新生SD大鼠耳蝸SGN的影響,定位ROS產(chǎn)生的位置并量化其表達(dá)水平,為進(jìn)一步研究SS致SGN損傷的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取新生2～3 d齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)SD大鼠21只,雌雄不限,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。耳蝸器官培養(yǎng)組6只,SGN原代培養(yǎng)組15只。其中耳蝸器官培養(yǎng)組隨機(jī)分為對(duì)照組和5 mM SS組,每組3只。SGN原代培養(yǎng)組隨機(jī)分為對(duì)照組、5 mM SS組、5 mM SS+N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)組、陽性對(duì)照過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)組、H2O2+NAC組,每組3只。

1.2主要儀器及試劑 主要儀器:細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(ThermoFisher公司),倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)。主要試劑:10×多聚賴氨酸和100×青鏈霉素混合液購自索萊寶公司;DMEM-F12(1∶1)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)購自Gibco公司;SS、4%多聚甲醛、Tritonx-100、山羊血清、H2O2購自Sigma公司;NAC購自阿拉丁公司;鼠抗βⅢ-Tubulin購自Abcam公司;Alexa-8890S標(biāo)記山羊抗鼠IgG熒光二抗購自美國(guó)CST公司;CCK8檢測(cè)試劑購自東仁化學(xué)科技有限公司;活性氧檢測(cè)試劑盒購自碧云天公司;貼壁得購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SGN原代培養(yǎng)及SS干預(yù)方法 SD大鼠經(jīng)75%酒精消毒后斷頭處死,對(duì)半剪開頭顱并剔除腦組織后放于4 ℃ PBS中,在解剖顯微鏡下分離出完整的耳蝸,剔除螺旋韌帶和基底膜,留取完整的蝸軸(即SGN所在部位),將其用胰蛋白酶消化10 min,離心、重懸后種植在用多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿上,將種植好的細(xì)胞放在細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用含胎牛血清及青鏈霉素混合液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進(jìn)行半換液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物干預(yù)。SS處理組用含5 mM SS的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),SS+NAC組用含100 μM NAC培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后再用含5 mM SS和100 μM NAC的混合培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),H2O2組用含300 μM H2O2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),H2O2+NAC組用含100 μM NAC培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后再加用含300 μM H2O2和100 μM NAC的混合培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 耳蝸器官處理及培養(yǎng) SD大鼠經(jīng)75%酒精消毒后斷頭處死,對(duì)半剪開頭顱并剔除腦組織后放于4 ℃ PBS中,在解剖顯微鏡下沿耳蝸縱軸剝開蝸殼,仔細(xì)分離螺旋韌帶,將含有Corti器及SGN的中回組織取出,平鋪在事先用貼壁得孵育過的培養(yǎng)皿上,用含胎牛血清及青鏈霉素混合液的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.3 SGN中氧化應(yīng)激水平檢測(cè) SGN加藥處理后,移除培養(yǎng)基,用DMEM-F12無血清培養(yǎng)基洗滌1次。加入ROS熒光探針DCFH-DA,在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,移除熒光探針,用DMEM-F12洗滌3次(5 min/次),加入4%多聚甲醛固定30 min,移除固定液,用PBS洗滌3次(15 min/次)。將培養(yǎng)物放入神經(jīng)元標(biāo)志βⅢ-Tubulin一抗溶液(含1% Tritonx-100+5%山羊血清)中,4 ℃孵育過夜。移除一抗溶液,用PBS洗滌3次(15 min/次),滴加Alexa-8890S標(biāo)記山羊抗鼠IgG熒光二抗溶液(含1%Tritonx-100+5%山羊血清),室溫避光孵育2 h。移除二抗溶液,用PBS洗滌3次(15 min/次)。滴加抗熒光淬滅劑,封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照,使用Image J軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化分析。

1.3.4 CCK8法檢測(cè)SGN細(xì)胞存活率 取原代培養(yǎng)SGN細(xì)胞接種于96孔板中,加藥處理48 h后移除藥物溶液。各孔加入100 μl DMEM-F12培養(yǎng)基后再加入10 μl CCK8反應(yīng)溶液,繼續(xù)孵育3 h。在酶標(biāo)儀下檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density,OD)值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空白組(加入等體積的DMEM-F12培養(yǎng)基及CCK8反應(yīng)溶液,不含細(xì)胞)。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率(%)=[(處理組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

2 結(jié)果

2.1SS與SGN氧化應(yīng)激水平 對(duì)于耳蝸器官培養(yǎng)SGN對(duì)照組和5 mM SS組,采用神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-Tubulin標(biāo)記SGN,SGN胞體和軸突均可見明顯的紅色熒光;ROS熒光探針DCFH-DA呈現(xiàn)綠色熒光,與對(duì)照組相比,經(jīng)5 mM SS干預(yù)48 h后ROS熒光在SGN處升高,而在其他位置熒光強(qiáng)度無明顯變化。見圖1。為進(jìn)一步量化ROS熒光強(qiáng)度,在原代培養(yǎng)大鼠SGN中,與對(duì)照組相比,5 mM SS干預(yù)48 h后,ROS平均熒光強(qiáng)度升高(P<0.001),與H2O2組結(jié)果一致(P<0.000 1)。見圖2。

注:??為對(duì)照組；?為??的融合圖；??為5 mM SS處理組；?為??融合圖

圖2 ROS在原代細(xì)胞中的表達(dá)及量化(200×)比較圖

2.2氧化應(yīng)激水平與細(xì)胞存活率 用氧化應(yīng)激抑制劑NAC處理后,與SS處理組對(duì)比,SGN氧化應(yīng)激水平下降(P<0.01)。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示,SS處理SGN 48 h后細(xì)胞存活率較對(duì)照組降低了41.34%(P<0.01)。在加入NAC之后,細(xì)胞存活率較SS組上升36.05%(P<0.01),與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。H2O2組處理SGN 48 h后細(xì)胞存活率較對(duì)照組下降52.31%(P<0.001),在加入NAC之后,SGN氧化應(yīng)激水平下降(P<0.0001),細(xì)胞存活率較H2O2組上升34.73%(P<0.01)。見圖3。

圖3 SGN在不同處理組中的細(xì)胞存活率比較圖

3 討論

3.1藥物性耳聾(drug-induced hearing loss,DIHL)是最常見的后天性感音神經(jīng)性聾。SS作為全球用量最大的非處方藥物阿司匹林的有效成分,可以高效、快速、穩(wěn)定、可逆地誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳鳴甚至雙側(cè)對(duì)稱的以高頻為主的輕度至中度聾,因此是研究DIHL的良好工具藥物。SGN是聽覺神經(jīng)通路的初級(jí)神經(jīng)元,噪聲、衰老、藥物等各種原因造成的感音神經(jīng)性聾,最終都造成SGN的不可逆損傷。本研究表明5 mM SS處理原代培養(yǎng)SGN 48 h后,細(xì)胞存活率下降。由于SGN缺乏再生能力,SGN的變性和喪失將導(dǎo)致不可逆感音神經(jīng)性聾。因此,探索SGN損傷的深層機(jī)制,對(duì)治療DIHL以及其他神經(jīng)性耳聾具有重要意義。

3.2SS致神經(jīng)元的損傷與興奮毒性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),SS顯著增加小腦旁絨球的谷氨酸水平,使其興奮性中間神經(jīng)元自發(fā)放電率顯著增加[10]。在聽覺系統(tǒng)中,SS能上調(diào)耳蝸背側(cè)核[11]、下丘以及聽皮層[12]NMDA受體表達(dá)。本課題組的前期研究也證實(shí),SS易化SGN的NMDA受體的電流[13],上調(diào)SGN的NMDA受體表達(dá)[14],促進(jìn)GABAA受體內(nèi)化[15],可逆地抑制GABAA受體電流[16],使興奮與抑制的平衡失調(diào)。這一系列的研究結(jié)果證實(shí)了SS可通過興奮毒性介導(dǎo)SGN損傷。

3.3SS致神經(jīng)元損傷的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激、凋亡密切相關(guān)。ROS通過引起細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能破壞等最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性或壞死[17]。本研究發(fā)現(xiàn)SS處理耳蝸器官48 h后,ROS在SGN上顯著升高,而在支持細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞中無明顯變化,提示SS選擇性增強(qiáng)SGN的氧化應(yīng)激水平。應(yīng)用氧化應(yīng)激抑制劑NAC可顯著降低SGN的氧化應(yīng)激水平,使細(xì)胞存活率上升,與陽性對(duì)照結(jié)果一致,提示SS通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激造成SGN死亡。本課題組此前的研究也發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的大鼠耳蝸器官中,SS作用48 h后導(dǎo)致SGN發(fā)生神經(jīng)纖維水泡化和斷裂,核固縮和核碎裂等凋亡形態(tài)學(xué)改變,并且具有SS濃度及處理時(shí)間依賴性。然而,毛細(xì)胞及支持細(xì)胞即使在SS高濃度(10 mM)和長(zhǎng)時(shí)間(96 h)的處理下,仍然沒有明顯的形態(tài)學(xué)損傷表現(xiàn)。SS處理后,只有SGN中的過氧化物陰離子增加,這提示SS可能選擇性地導(dǎo)致SGN產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[9]。Abd-Elhakim等[18]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠大腦皮層和海馬組織中,SS提高了丙二醛和caspase-3水平,但總抗氧化能力和B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)水平降低,神經(jīng)元變性壞死。另外,SS使人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y內(nèi)的ROS水平增加,caspase-3表達(dá)增加,導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[8]。其他的非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)如雙氯芬酸作用SH-SY5Y后,使ROS水平升高,caspase-3、caspase-8、bax、細(xì)胞色素c和p53表達(dá)水平升高,抗凋亡Bcl-2水平降低,引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[19]。不僅在神經(jīng)元中,SS亦造成其他細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)SS可以通過激活Rac1-NAPDH氧化酶依賴途徑使ROS增加,進(jìn)而造成線粒體膜電位下降,caspase激活,導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡[20]。在PEL原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞和C6膠質(zhì)細(xì)胞中,SS均導(dǎo)致ROS大量生成,最終造成細(xì)胞凋亡[21-22]。這一系列的研究結(jié)果表明,SS通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)SGN損傷。

3.4在神經(jīng)元中,胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)升高能夠增強(qiáng)氧化應(yīng)激。在分離的線粒體中發(fā)現(xiàn),高濃度的Ca2+通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔增加ROS的生成[23]。而在氟化鈉誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞毒性損傷中發(fā)現(xiàn),[Ca2+]i升高伴隨ROS增加,Ca2+螯合劑可以抑制ROS生成,但抗氧化劑不能抑制[Ca2+]i上調(diào),表明[Ca2+]i上調(diào)是氧化應(yīng)激的上游介導(dǎo)因素[24]。SS能升高神經(jīng)元的[Ca2+]i。小鼠被注射SS后,大腦神經(jīng)元中鈣相關(guān)的活動(dòng)增強(qiáng)[25]。SS也增強(qiáng)耳蝸背側(cè)核神經(jīng)元的鈣內(nèi)流[26]。本課題組的前期研究證實(shí)了SS易化NMDA受體電流(一種配體門控鈣內(nèi)流)[13],其他學(xué)者也證實(shí)了阿司匹林選擇性增強(qiáng)SGN中NMDA誘導(dǎo)的電流[27]。當(dāng)NMDA受體被過度激活時(shí),[Ca2+]i會(huì)急劇上升,并引起興奮毒性[28]。上述結(jié)果提示,SS通過易化SGN的NMDA受體,升高[Ca2+]i,并可能由此增強(qiáng)SGN的氧化應(yīng)激,進(jìn)而介導(dǎo)SGN損傷。

綜上所述,SS通過增強(qiáng)SGN的氧化應(yīng)激引起SGN的損傷,使用氧化應(yīng)激抑制劑能夠降低SGN的氧化應(yīng)激,并且對(duì)SS致SGN損傷具有保護(hù)作用。關(guān)于氧化應(yīng)激引起SGN損傷的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。