林鉆平, 贠 露, 甘函簫, 徐慧蘭, 唐鳳珠, 唐 杰, 陳睿春, 李鳳提, 林敢生

耳聾是殘疾的主要病因之一,嚴(yán)重影響患者交流、學(xué)習(xí)和生活。據(jù)統(tǒng)計(jì),2015年全球約有5億耳聾患者[1],每1 000名新生兒就有1～3例罹患聽(tīng)力殘疾,其中主要由遺傳因素所導(dǎo)致者約占一半以上[2]。耳聾常見(jiàn)病因包括遺傳因素和環(huán)境因素,大部分患者為非綜合征型耳聾(nonsyndromic hearing loss,NSHL),約占70%。我國(guó)最常見(jiàn)的遺傳性耳聾基因是GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA、GJB3[3]。目前,對(duì)于我國(guó)人群聽(tīng)力障礙的患病率調(diào)查研究較少,最近的數(shù)據(jù)可追溯至2006年第2次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查,其結(jié)果顯示,聽(tīng)力殘疾者約有2 780萬(wàn)人。2010年廣西聽(tīng)力殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示,聽(tīng)力殘疾在殘疾人口中占比最高,約有84.8萬(wàn)人[4]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),廣西感音神經(jīng)性聾患者耳聾基因突變率低于全國(guó)平均水平,其主要突變基因是GJB2,其次是SLC26A4[5]。為進(jìn)一步了解廣西耳聾基因突變情況,本研究通過(guò)耳聾基因芯片對(duì)廣西336例先天性耳聾患者及其家系成員進(jìn)行篩查,分析其基因突變特征,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 招募2017年12月至2022年12月我院耳鼻咽喉頭頸科門診收治的NSHL先證者及其直系血緣親屬共336例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的先天性遺傳性耳聾患者,且父母雙方三代均為廣西人,長(zhǎng)期居住在廣西20年以上;(2)患者和家屬同意參加本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷為非遺傳性耳聾患者(如傳導(dǎo)性耳聾)或伴有全身疾病者、智力障礙者,既往有腦炎、腦膜炎、腮腺炎等明確非遺傳因素致聾病史者;(2)家族三代內(nèi)有外地遷移或者有與省外或國(guó)外種族聯(lián)姻家族史的患者;(3)患者和家屬不同意參加本研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(科研廣西科技-2017-29號(hào))。

1.1.1 耳聾家系招募 招募到21個(gè)耳聾家系(先證者21例),耳聾患者52例,聽(tīng)力正常的親屬30例,共82例。其中男42例,女40例;年齡1～52歲,平均年齡20.81歲。根據(jù)耳聾程度分類:雙耳極重度感音神經(jīng)性聾34例,雙耳中度感音神經(jīng)性聾3例,雙耳輕度感音神經(jīng)性聾5例,雙耳輕度傳導(dǎo)性聾1例,左耳輕度感音神經(jīng)性聾2例,左耳重度、右耳極重度感音神經(jīng)性聾2例,右耳重度、左耳極重度感音神經(jīng)性聾1例,左耳重度、右耳中度感音神經(jīng)性聾1例,左耳極重度感音神經(jīng)性聾1例,右耳輕度感音神經(jīng)性聾1例,左耳重度混合性聾1例。

1.1.2 散發(fā)耳聾招募 招募到散發(fā)耳聾患者106例,其聽(tīng)力正常直系血緣親屬148例,共254例。其中男124例,女130例;年齡4個(gè)月～56歲,平均年齡22.3歲。根據(jù)耳聾程度分類:雙耳極重度感音神經(jīng)性聾91例,雙耳重度感音神經(jīng)性聾7例,雙耳中度感音神經(jīng)性聾4例,右耳重度、左耳極重度感音神經(jīng)性聾1例,右耳極重度、左耳重度感音神經(jīng)性聾1例,左耳極重度感音神經(jīng)性聾1例,右耳極重度感音神經(jīng)性聾1例。

1.2聽(tīng)力學(xué)評(píng)估方法 參照世界衛(wèi)生組織防聾和聽(tīng)力損失項(xiàng)目報(bào)告(1997年,日內(nèi)瓦),以0.5、1.0、2.0、4.0 KHz頻率計(jì)算平均聽(tīng)閾,聽(tīng)力損失分為4級(jí):(1)輕度聾:26～40 dB HL;(2)中度聾:41～60 dB HL;(3)重度聾:61～80 dB HL;(4)極重度聾:≥81 dB HL。成人主要采取純音測(cè)聽(tīng)(pure tone audiometry,PTA)檢查,對(duì)于不能完成主觀聽(tīng)力檢查的患兒采用客觀聽(tīng)力檢查[聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)檢查、耳聲發(fā)射(otoacoustic emisson,OAE)檢查和多頻穩(wěn)態(tài)誘發(fā)電位(multiple auditory steady-state evoked responses,ASSR)檢查]進(jìn)行評(píng)估。

1.3基因檢測(cè)方法 采集研究對(duì)象外周靜脈血3～5 ml,避免震蕩,-20 ℃保存?zhèn)錂z,并建立紙質(zhì)及電子檔案。應(yīng)用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑[粵深械備20150099號(hào);型號(hào):全血DNA(離心柱型)]及其配套儀器進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌及掃描,檢測(cè)樣本4個(gè)常見(jiàn)致聾基因的16個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn):GJB2(35delG、176-191del16、235delC、299-300delAT),GJB3(538C>T、547G>A),SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A),線粒體12S rRNA(1494C>T、1555A>G)。根據(jù)熒光雜交信號(hào)和耳聾基因微陣列芯片探針排布位置進(jìn)行信號(hào)讀取及結(jié)果判讀。見(jiàn)圖1。

?野生型；?GJB2 235delC雜合突變；?GJB2 235delC純合突變；?GJB2 299-300delAT雜合突變；?GJB2 176-191del16雜合突變；?GJB2 176-191del16/235delC復(fù)合雜合突變；?SLC26A4 IVS7-2A>G雜合突變；?SLC26A4 1229C>T雜合突變；?SLC26A4 IVS7-2A>G/1229C>T復(fù)合雜合突變；?線粒體12S rRNA 1494C>T突變

2 結(jié)果

2.1耳聾患者基因突變檢出情況及突變特征 158例耳聾患者中共檢出常見(jiàn)耳聾基因突變24例(15.19%,24/158)。其中SLC26A4基因突變15例(9.49%,15/158),GJB2基因突變8例(5.06%,8/158),線粒體12S rRNA突變1例(0.63%,1/158)。見(jiàn)表1。

表1 158例耳聾患者基因突變檢出情況及突變特征

2.2聽(tīng)力正常耳聾患者親屬基因突變檢出情況及突變特征 178例聽(tīng)力正常的耳聾患者親屬共檢出22例基因突變,檢出率為12.36%(22/178)。其中SLC26A4基因突變12例(6.74%,12/178),GJB2基因突變10例(5.62%,10/178)。見(jiàn)表2。

表2 178例聽(tīng)力正常耳聾患者親屬基因突變檢出情況及突變特征

3 討論

3.1耳聾是一種嚴(yán)重影響患者身心健康的疾病,對(duì)患者的情感和認(rèn)知發(fā)展都有深遠(yuǎn)影響。研究表明,一半以上的耳聾與遺傳密切相關(guān),遺傳性耳聾中,先天性NSHL占70%左右,約80%的病例為常染色體隱性遺傳,15%為常染色體顯性遺傳,1%～2%為線粒體或X連鎖遺傳。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了140多個(gè)與耳聾密切相關(guān)基因[6]。我國(guó)常見(jiàn)的NSHL致病基因有GJB2、SLC26A4、GJB3和線粒體12S rRNA,還有新近發(fā)現(xiàn)的MYO7A及TECTA基因等[3]。對(duì)這些基因開(kāi)展研究可幫助研究者從分子水平上認(rèn)識(shí)耳聾遺傳學(xué),并可為患者提供個(gè)性、精準(zhǔn)的臨床咨詢。

3.2GJB2基因是世界各地導(dǎo)致遺傳性耳聾的最常見(jiàn)突變基因,是常染色體隱性遺傳性耳聾的主要致病基因[7]。GJB2的突變導(dǎo)致Cx26蛋白在耳蝸中異常表達(dá),Cx26蛋白是維持鉀離子循環(huán)通路的重要因子,其異常表達(dá)會(huì)使內(nèi)耳淋巴液中鉀離子失衡,導(dǎo)致聽(tīng)力損害[8]。目前已知的GJB2基因突變類型有100余種[9],我國(guó)最為常見(jiàn)的是235delC,235delC突變導(dǎo)致第79位密碼子后面發(fā)生移碼突變[10]。Koohiyan等[11]針對(duì)332個(gè)不相關(guān)的家族開(kāi)展研究,發(fā)現(xiàn)GJB2突變的平均頻率為16%,且通過(guò)對(duì)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行系統(tǒng)搜索發(fā)現(xiàn),不同種族群體的GJB2突變率存在差異。我國(guó)不同地區(qū)GJB2突變頻率也不盡相同,Dai等[12]研究顯示我國(guó)不同地區(qū)NSHL患者中GJB2突變的頻率為4%～30.4%,湖南地區(qū)耳聾患者的GJB2基因突變檢出率為22.08%(34/154)[13],山西太原地區(qū)的GJB2基因突變檢出率為20.16%(26/129)[14],浙江地區(qū)的檢出率則為24.81%(452/1 822)[15]。本研究結(jié)果顯示,廣西地區(qū)158例先天性耳聾患者中GJB2基因突變檢出率為5.06%(8/158),低于上述我國(guó)其他地區(qū)研究的檢出率,可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。本研究中有1例患兒檢出GJB2 c.235delC純合突變,遺傳自均是GJB2 c.235delC單雜合突變的父母;另1例患兒檢出GJBc.176-191del16/c.235delC復(fù)合雜合突變,父母分別是GJBc.176-191del16和GJBc.235delC單雜合突變,明確了致病基因。其余6例患者檢出GJB單雜合突變,提示可能存在同一基因的不同位點(diǎn)突變,可通過(guò)基因靶向測(cè)序明確病因。有10例聽(tīng)力正常者檢出GJB雜合突變?yōu)殡[性攜帶者,后續(xù)可對(duì)其配偶進(jìn)行該基因檢測(cè),以提供優(yōu)生建議。

3.3SLC26A4基因是我國(guó)第二大常見(jiàn)耳聾基因,突變檢出率僅次于GJB2基因。SLC26A4基因突變可以通過(guò)一系列病理、生理改變導(dǎo)致耳聾,其可編碼具有生理功能的Pendrin蛋白,主要表達(dá)于內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊等結(jié)構(gòu)中,參與氯離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持內(nèi)耳中內(nèi)淋巴液系統(tǒng)的離子平衡狀態(tài)[16]。內(nèi)耳是聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的重要構(gòu)成部分,有感音、聲音-生物信號(hào)傳遞等重要生理功能。有研究顯示,我國(guó)SLC26A4基因突變攜帶率為2%～3%。該基因突變極易導(dǎo)致大前庭導(dǎo)水管綜合征,97.9%的大前庭導(dǎo)水管綜合征患者攜帶SLC26A4基因突變[17]。大前庭水管綜合征患者聽(tīng)力下降的發(fā)病時(shí)間一般較晚,且發(fā)病及病情加重多與導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高的誘發(fā)因素有關(guān),包括感冒、頭部外傷等。通過(guò)耳聾基因檢測(cè)和影像學(xué)檢查可早期篩查此類患者,及早干預(yù),有利于降低重度、極重度耳聾的發(fā)病率。在我國(guó)不同地區(qū)耳聾人群中,SLC26A4基因突變頻率為4.76%～24.4%,其中廣西柳州的SLC26A4基因突變頻率為6.21%[18]。在本研究中,158例耳聾患者中有15例(9.49%)檢出SLC26A4基因突變。而針對(duì)全部336例的SLC26A4基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)篩查結(jié)果顯示,基因突變檢出率為8.04%(27/336),是本組研究人群中排名第1位的致聾基因,提示本地區(qū)SLC26A4基因突變攜帶率可能處于高發(fā)水平。

3.4線粒體12S rRNA突變是引起藥物性耳聾的常見(jiàn)致病因素,屬于母系遺傳。Prezant于1993年首次證實(shí)mtDNA突變存在于氨基糖苷類抗生素使用導(dǎo)致的耳聾,使得遺傳因素在藥物性耳聾發(fā)病中的重要性逐漸受到重視。此后,臨床上開(kāi)始關(guān)注這種特殊的耳聾,攜帶線粒體12S rRNA基因突變的人群有很大風(fēng)險(xiǎn)在常規(guī)使用氨基糖苷類抗生素時(shí)造成不可逆的聽(tīng)力下降。目前,對(duì)于線粒體12S rRNA研究比較多的是1555A>G和1494C>T突變,因?yàn)檫@2個(gè)位點(diǎn)突變會(huì)在12S rRNA高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555堿基對(duì),改變氨基糖苷類的結(jié)合位點(diǎn),使人類的線粒體核糖體與細(xì)菌的相似,更易與氨基糖苷類抗生素結(jié)合,誘發(fā)或加重?cái)y帶這些突變個(gè)體的聽(tīng)力損害[19]。有針對(duì)山東地區(qū)新生兒耳聾基因及聽(tīng)力篩查的結(jié)果顯示,線粒體12S rRNA突變檢出率達(dá)0.21%[20];而針對(duì)成都地區(qū)1 427例聽(tīng)力障礙患者的篩查發(fā)現(xiàn),線粒體12S rRNA突變率高達(dá)5.96%[21]。本組研究發(fā)現(xiàn)1例線粒體12S rRNA 1494C>T突變患者,在耳聾患者中的檢出率為0.63%,低于上述研究結(jié)果,雖未能對(duì)其母親進(jìn)行采樣,但可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)該家系成員用藥,避免其后代因使用氨基糖苷類藥物而致聾。

3.5GJB3基因是1998年在我國(guó)本土克隆和鑒定的第一個(gè)耳聾致病基因[22],可引起常染色體隱性或顯性遺傳性NSHL。綜合諸多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果,筆者認(rèn)為該基因突變率整體偏低,且國(guó)內(nèi)各地區(qū)差異較大。本組336例受檢者均未檢出GJB3基因突變,后期進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè),若仍未發(fā)現(xiàn)GJB3基因突變,則可以考慮暫不納入廣西地區(qū)先天性遺傳性耳聾的常規(guī)基因檢測(cè)中。

綜上所述,SLC26A4和GJB2是廣西地區(qū)人群遺傳性耳聾的常見(jiàn)突變基因,其中SLC26A4c.IVS7-2A>G位點(diǎn)突變率最高(6.85%,23/336),其次為GJB2c.235delC突變(3.87%,13/336)。本組耳聾人群中與篩查位點(diǎn)有關(guān)的突變比例高達(dá)15.19%,與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究相似,其中耳聾患者家屬基因突變檢出率達(dá)12.36%,說(shuō)明熱點(diǎn)突變?cè)诙@人群中存在比例高,有必要在耳聾人群體中進(jìn)行熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的篩查,其中SLC26A4c.IVS7-2A>G和GJB2c.235delC應(yīng)列為廣西耳聾基因篩查的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,為生育咨詢提供信息。