劉 燕, 鐘鳴駿, 熊文羽, 彭 婉, 盧 宇

耳聾是臨床上最常見的感覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷之一,據(jù)2021年《世界聽力報告》統(tǒng)計,目前全世界存在不同程度聽力損失的人數(shù)超過15億,預計到2050年可能會增加到25億人[1]。第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查顯示,我國聽力障礙殘疾人口有2 780萬人,占殘疾人總數(shù)的33.5%[2]。耳聾在我國是常見的出生缺陷,其中遺傳因素占早發(fā)性耳聾病因的60%以上,常染色體隱性遺傳是最主要的遺傳方式[3]。根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)疾病,耳聾分為非綜合征型和綜合征型,其中非綜合征型約占70%。目前已報道超過120個導致非綜合征型耳聾的基因,在中國人群中最常見的GJB2、SLC26A4、OTOF、MYO15A和MYO7A等常染色體隱性遺傳耳聾基因已有大量文獻報道。對早發(fā)性重度以上感音神經(jīng)性聽力損失,盡早施行人工耳蝸植入和言語康復訓練是最有效的治療方法[4]。人工耳蝸是通過體外設備采集聲音信號,經(jīng)信號處理后無線傳輸至植入頭皮下的信號處理裝置,再將電信號傳送至植入耳蝸的電極,電極通過放電直接刺激聽神經(jīng),最終信號傳到大腦,從而感知聲音。人工耳蝸傳導的聽覺信號繞過耳蝸病變部位,直接刺激患者的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和聽神經(jīng),幫助患者改善或獲得聽覺。因此,大多數(shù)耳聾患者在人工耳蝸植入術后配合規(guī)范的聽力和言語康復訓練可獲得不同程度的聽力和言語功能的提高。但臨床上也有部分患者在人工耳蝸植入后康復效果不佳,這不僅與植入年齡、言語康復訓練等因素有關,還與患者耳聾的病變部位和病理機制有關[5]。不同的基因突變導致耳聾的病理機制和病變部位存在差異,因此可能造成人工耳蝸效果的差異。通過基因診斷明確患者聽覺系統(tǒng)的分子病理學改變,有助于對人工耳蝸植入的預后進行評估,避免無效植入。本研究通過二代測序在1例語前極重度非綜合征型耳聾患者中發(fā)現(xiàn)ESPN基因c.1916-1G>A純合突變,明確了罕見的剪切位點新突變是該家庭的致聾原因,并對ESPN基因?qū)е露@的遺傳特點、臨床表型和人工耳蝸康復效果進行總結分析。

1 對象與方法

1.1研究對象 本研究家系是來自廣西壯族自治區(qū)的壯族家系。采樣小組對先證者及其親屬成員進行了家系調(diào)查,收集家系成員臨床資料,對先證者進行詳細病史資料收集(包括現(xiàn)病史、既往史、母親圍生期風險和用藥史等),進行常規(guī)體格檢查、聽力學檢查等。采集各家庭成員外周靜脈血5 ml,提取基因組DNA凍存?zhèn)溆谩１狙芯揩@四川大學華西醫(yī)院倫理委員會批準[批號:2021年審(190)號],參與研究的家系成員均簽署知情同意書。

1.2全基因組檢測和數(shù)據(jù)分析 使用華大智造DNBSEQ-T7測序平臺對先證者血液提取到的DNA進行全基因組測序,下機原始數(shù)據(jù)使用BWA軟件與參考基因組序列(GRCh38)進行比對,使用基于GATK Haplotype Caller開發(fā)的Saile calling算法提取突變信息。對突變進行質(zhì)量控制過濾:read depth>6,genotype qualities>20,allele frequency>10%。使用VarSeq軟件對突變進行人群頻率(gnomAD、dbSNP、1000 Genomes人群數(shù)據(jù)庫)注釋,過濾次等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)≥0.005的突變位點;過濾掉ClinVar數(shù)據(jù)庫注釋為Benign的突變。篩選耳聾基因編碼區(qū)和剪切位點區(qū)域的突變,對候選突變進行致病性分析。

1.3Sanger測序驗證 根據(jù)二代測序檢出的候選致病基因突變,設計驗證引物,對家系相關成員進行雙向Sanger測序驗證。測序數(shù)據(jù)通過質(zhì)控后,應用Mutation-Surveyor軟件進行序列比對,判讀基因型,分析檢出突變是否符合家系內(nèi)聽力表型和基因型共分離。

1.4人工耳蝸術后聽覺與言語康復效果評價 應用有意義聽覺整合量表(Meaningful Auditory Integration Scale,MAIS)和有意義使用言語量表(Meaningful Use of Speech Scale,MUSS)對患兒/先證者的實際交流環(huán)境下的聽覺能力與言語能力進行有效評估[6]。MAIS總分為40分,得分越高提示患者聽覺能力發(fā)展越好。MUSS由患兒家長對開放式問題進行詳細回答,可通過舉例對患兒日常生活中言語行為進行詳細描述,評估者根據(jù)患兒家長對言語發(fā)生行為出現(xiàn)頻率的描述進行評分,每個問題的分值為0～4分,總分為40分,分數(shù)越高提示患兒的言語能力越強。

2 結果

2.1患兒病史及臨床表現(xiàn) 先證者男性,1歲時父母發(fā)現(xiàn)患兒聽力下降,4歲就診于當?shù)蒯t(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診,進行純音測聽、聲導抗、聽性腦干反應、畸變耳聲發(fā)射等詳細聽力學評估,以及顳骨CT掃描檢查,結果提示為雙側對稱的重度感音神經(jīng)性耳聾,無內(nèi)耳畸形,無前庭功能障礙,無其他系統(tǒng)疾病,無頭部外傷史、耳毒性藥物及噪聲暴露史,母親圍生期無特殊疾病和藥物接觸史。父母聽力正常,非近親婚配,無耳聾家族史?；純?歲進行了右耳人工耳蝸植入手術,術后無并發(fā)癥,開機正常,在當?shù)乜祻蜋C構進行2年言語康復訓練。

2.2致病基因鑒定結果 對先證者進行全基因組測序,下機數(shù)據(jù)通過質(zhì)控、去重和過濾后,根據(jù)遺傳方式、表型特征、VEP Impact注釋等條件進行篩查后得到1個候選基因突變:ESPN基因純合突變c.1916-1G>A。該突變此前未見報道,在gnomAD數(shù)據(jù)庫中未檢出。

2.3Sanger測序驗證結果 結果表明,患兒基因型為ESPN基因c.1916-1G>A純合突變?；純焊改嘎犃φ?均攜帶c.1916-1G>A雜合突變。先證者的純合突變分別來自于父母,家系內(nèi)基因型與表型共分離,初步推斷ESPN基因c.1916-1G>A純合突變?yōu)榛純憾@的致病原因。家系圖及Sanger測序圖譜見圖1。

2.4突變致病性分析結果 先證者檢出的ESPN基因c.1916-1G>A是剪接位點突變,通過影響mRNA剪接導致轉錄過程中相應外顯子缺失,從而生成截短蛋白,造成功能缺陷。該突變在gnomAD等人群數(shù)據(jù)庫中均未檢出,屬于極罕見突變;該突變在家系中符合基因型-表型共分離,符合常染色體隱性遺傳方式。總結ESPN基因在ClinVar和DVD數(shù)據(jù)庫已報道的致病性突變[7-19],本研究發(fā)現(xiàn)的截短突變是ESPN基因常染色體隱性遺傳方式最常見的突變類型(見圖2),c.1916-1G>A導致截短蛋白缺失了重要的功能域(見圖3)。ESPN基因c.1916-1G>A為致病性突變。

ClinVar和DVD數(shù)據(jù)庫收錄的致病性和可能致病性突變,以及本研究發(fā)現(xiàn)的突變:錯義突變9個,框內(nèi)突變1個,移碼突變7個,無義突變5個,剪切突變2個

圖示Espin蛋白結構及突變所在結構域;綠色字體為本研究發(fā)現(xiàn)突變,紅色字體為常染色體顯性遺傳突變,黑色字體為常染色體隱性遺傳突變

2.5人工耳蝸術后聽覺與言語康復效果評價 患兒術后在當?shù)匮哉Z康復機構學習2年,術后5年進行康復效果評估?；純焊改刚J為康復效果良好,能夠通過人工耳蝸進行日常言語溝通。MAIS評分得分35分(總分40分),MUSS評分得分38分(總分40分),證明其聽覺與言語康復效果良好。

3 討論

3.1本研究報道了1例語前重度感音神經(jīng)性耳聾患兒,通過全基因組測序檢出ESPN基因c.1916-1G>A純合突變,這是通過改變mRNA剪接導致基因功能缺陷的致病性突變,患兒表型符合ESPN基因?qū)е碌某Ｈ旧w隱性遺傳非綜合征型耳聾典型特征,因此ESPN基因c.1916-1G>A純合突變是該患兒的致病原因。

3.2ESPN基因由13個外顯子組成,編碼854個氨基酸的Espin蛋白,是一種肌動蛋白結合蛋白。在Espin的N端有8個重復的錨蛋白(ankyrin repeats),在2個富含脯氨酸的區(qū)域(PR1和PR2)中間是1個肌動蛋白結合域xAB,接著是WH2結構域,其包含ATP或GTP共同結合位點,在C末端有2個肌動蛋白結合位點構成ABM模塊[20]。Espin蛋白在內(nèi)耳毛細胞纖毛中表達,纖毛是內(nèi)耳毛細胞頂端表面突出的特殊微絨毛,其核心由平行的肌動蛋白絲束密集排列而成[21]。Espin可交聯(lián)肌動蛋白絲使立體纖毛的肌動蛋白絲束規(guī)律排列,不同濃度的Espin可以決定蛋白絲延伸的程度,從而決定平行的肌動蛋白絲束的長度[22]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠中ESPN基因純合突變會導致毛細胞缺陷從而引起耳聾和前庭功能障礙[23]。

3.3ESPN基因缺陷導致的常染色體隱性遺傳耳聾典型表現(xiàn)為學語前發(fā)病的重度或極重度感音神經(jīng)性耳聾,部分患者可合并前庭功能障礙。Naz等[7]2004年報道了2個巴基斯坦的語前極重度耳聾合并前庭功能障礙的近親婚配家系,通過連鎖分析,這2個常染色體隱性遺傳家系的致病基因均定位于1p36.3,并最終鑒定致病基因均為ESPN基因。Donaudy等[24]2006年報道了ESPN基因雜合突變導致的常染色體顯性遺傳耳聾,報道的4例患者表型差異較大,發(fā)病年齡4～42歲,聽力損失程度為輕度至重度不等,但其基因型表型關聯(lián)尚缺乏確定性證據(jù)。

3.4目前對ESPN突變導致耳聾的病例報告較少,在ClinVar和DVD數(shù)據(jù)庫中收錄導致非綜合征型耳聾的致病性和可能致病性的突變一共27個,其中23個導致常染色體隱性遺傳耳聾的突變類型以截短突變(包括移碼突變、無義突變和剪切突變)為主。ClinVar數(shù)據(jù)庫中有一個剪切突變位點(c.1916-1G>C)與本研究發(fā)現(xiàn)的突變(c.1916-1G>A)位置一致,都會通過影響剪接導致基因功能缺陷,這也進一步驗證了本研究報道突變的致病性。

3.5ESPN基因已報道的致病性突變中,以常染色體隱性遺傳耳聾為主,只有4個非截短突變(錯義突變和框內(nèi)突變)為常染色體顯性遺傳,提示兩種遺傳方式可能是不同突變致病機制造成的。導致常染色體顯性遺傳耳聾的突變主要集中在肌動蛋白結合位點ABM模塊中,該位置的突變可能使Espin與肌動蛋白絲交聯(lián)失敗,導致纖毛病變而致病。

3.6已報道的常染色體隱性遺傳耳聾家系中大部分為近親婚配[7-8],而本研究中發(fā)現(xiàn)的廣西家庭為非近親婚配家庭,但患者檢出極罕見突變的純合子?；蛲蛔冾l率及熱點突變具有種族特異性和民族特異性,在不同的地區(qū)和民族中,耳聾基因突變譜和優(yōu)勢突變不同,本研究中發(fā)現(xiàn)的突變位點在各人群數(shù)據(jù)庫中均未檢出,其是否為廣西當?shù)孛褡逄禺愋酝蛔冇写M一步研究。

3.7對于重度和極重度感覺神經(jīng)性聽力損失的患者,人工耳蝸植入是最有效的治療方法。目前全球有65萬人接受了人工耳蝸植入,但是約有7%患者聽覺植入后效果差,有多方面的原因[5]。其中遺傳因素很重要,除GJB2、SLC26A4基因突變患者人工耳蝸植入效果明確以外,其他基因突變對人工耳蝸植入效果的報道很少。ESPN基因缺陷患者的人工耳蝸植入效果此前未見報道,不能形成術前評估的指導性意見。本研究中患者人工耳蝸術后經(jīng)過系統(tǒng)性言語康復訓練,言語康復效果良好,證實ESPN基因c.1916-1G>A純合突變致耳聾可以進行人工耳蝸手術,為人工耳蝸術前評估提供遺傳學參考證據(jù)。

對全國不同區(qū)域及民族的耳聾人群進行深入研究,明確各地區(qū)各民族耳聾基因的診斷率、特定耳聾基因突變的人群頻率等特點,能夠為遺傳性耳聾基因篩查和基因診斷提供更加準確的參考依據(jù),對制定精準的遺傳咨詢服務和人工耳蝸植入評估具有重要意義。