王思霽, 郭億蓮, 鐘鳴駿, 耿 佳, 彭 婉, 袁德健, 嚴提珍, 盧 宇

耳聾是最常見的感覺系統(tǒng)缺陷疾病之一,受遺傳、慢性感染、長期聲暴露、耳毒性藥物和衰老等多方面因素影響,其中遺傳因素是早發(fā)性耳聾的主要致病原因,約占60%[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,全世界有近5億人需要聽力康復,到2050年,將有超過7億人,即十分之一人口發(fā)生聽力損失。聽力損失的預防、識別和康復為家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟和精神負擔[3]。隨著高通量DNA測序技術在遺傳性耳聾領域的不斷發(fā)展和普及,大規(guī)模平行測序(massively parallel sequencing,MPS)和全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)使得40%～50%的遺傳性耳聾患者能夠明確基因診斷,對于未找到遺傳病因的部分患者在常染色體隱性遺傳相關基因中有時僅能檢測到單雜合致病性突變或者致病性無法確定的同義或錯義突變[4]。同義突變以往常常被認為是無臨床意義的核苷酸替換,尤其是人群頻率較高的同義突變在突變過濾時通常會被過濾掉。MYO15A基因是最常見的常染色體隱性非綜合征型耳聾(autosomal recessive non-syndromic hearing loss,ARNSHL)致病基因之一,迄今為止,該基因已鑒定出超過200個突變與耳聾相關[5]。MYO15A基因所編碼的肌球蛋白XVa對維持耳蝸毛細胞內(nèi)肌球蛋白組織結構及毛細胞靜纖毛的長度至關重要,其功能的喪失主要導致先天性雙側重度或極重度感音神經(jīng)性耳聾,部分位于N-端區(qū)域的突變可導致有殘余聽力的輕中度感音神經(jīng)性耳聾[6-8]。本研究通過MPS技術,在一個遺傳性非綜合征型耳聾家系中鑒定出MYO15A:NM_016239.4:c.8182C>G(p.Arg2728Gly)/c.9861C>T(p.Gly3287=)復合雜合突變。同時總結了在中國大型耳聾隊列數(shù)據(jù)庫中,c.9861C>T(p.Gly3287=)同義突變的基因型-表型特征以及在中國廣西壯族人群中的等位基因頻率。

1 資料與方法

1.1家系資料采集 該家系由華西醫(yī)院罕見病研究院團隊采集自廣東省中山市,研究獲醫(yī)院倫理委員會批準[2021年審(190)號],家系編號HL-001631。參與研究的家系所有成員簽署知情同意書。對家系成員進行問卷調(diào)查、聽力學檢查、體格檢査等,并采集外周血5 ml,提取DNA,-80 ℃凍存待檢。

1.2高通量測序和數(shù)據(jù)分析

1.2.1 測序及突變位點致病性分析 使用課題組自主研發(fā)的目標區(qū)域捕獲試劑盒HHL-785進行檢測,該試劑盒覆蓋目前已知耳聾致病基因及聽覺相關的基因共計785個。目標區(qū)域涵蓋了785個基因的外顯子、外顯子上下游50 bp及線粒體DNA序列。以GRCh37/hg19為參考序列,測序下機原始序列數(shù)據(jù)應用BWA軟件進行比對和定位,以Picard工具進行質(zhì)控和去重操作,使用GATK和VEP工具進行突變識別和注釋,次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)按<0.5%進行過濾,結合先證者及其家系成員的臨床表型和遺傳方式篩查候選突變,針對可疑突變位點檢索遺傳突變-臨床表型相關數(shù)據(jù)庫[ClinVar、DVD、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)]獲取更詳盡的位點致病信息。最后,參考美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會和分子病理學協(xié)會(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)遺傳突變分類標準與指南對突變位點進行致病性判讀[9]。

1.2.2 本研究同義突變在中國耳聾和對照人群檢出情況 中國耳聾基因研究戰(zhàn)略聯(lián)盟(Chinese Deafness Genetics Consortium,CDGC)數(shù)據(jù)庫是目前國內(nèi)最大的耳聾專病隊列和基因組數(shù)據(jù)庫,已收集涵蓋全國31個省(自治區(qū)、直轄市)41個民族的20 000余例耳聾病例,并有7 000余例聽力正常的對照人群?？偨Y該隊列中MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)鑒定為致病突變的耳聾患者的基因型-表型,并統(tǒng)計該位點在人群中的攜帶率。

2 結果

2.1HL-001631家系資料及聽力學特征分析結果HL-001631家系遺傳圖譜(見圖1?)符合常染色體隱性遺傳模式,早發(fā)性耳聾患者4例,參與本研究的家系成員2例(Ⅱ-1、Ⅱ-3),其中先證者(Ⅱ-1)為61歲中年男性,其二弟(Ⅱ-3)47歲。2例患者均為非進展性語前聾,中山市中醫(yī)院純音測聽提示雙側極重度感音神經(jīng)性耳聾(見圖1??),其他系統(tǒng)未見明顯異常,無長期噪聲暴露史及耳毒性藥物用藥史。先證者母親(Ⅰ-2)自述在75歲左右出現(xiàn)進行性聽力下降,檢測時已85歲,純音測聽表現(xiàn)為高頻下降明顯的重度-極重度聽力損失,考慮為老年性聾可能(見圖1?)。

圖1 HL-001631家系圖及純音聽閾圖

2.2致病基因鑒定結果 對病例Ⅱ-1和Ⅱ-3進行高通量測序分析,下機數(shù)據(jù)通過質(zhì)控和去重后,使用GATK和VEP進行突變識別和注釋。以MAF值<0.5%進行突變位點過濾,同時過濾掉ClinVar數(shù)據(jù)庫中良性和可能良性的突變。根據(jù)家系耳聾遺傳模式、聽力表型、VEP Impact注釋等條件對剩余位點進行篩查,同時在ClinVar、DVD、HGMD等突變注釋數(shù)據(jù)庫中核查可疑候選基因突變。在已知耳聾基因MYO15A中檢出NM_016239.4:c.8182C>G(p.Arg2728Gly)/c.9861C>T(p.Gly3287=)復合雜合突變(見圖2),2個突變均為已報道的致病性突變。錯義突變p.Arg2728Gly于2019年在中國臺灣非綜合征型耳聾家系中被首次鑒定[10]。同義突變p.Gly3287=首次報道于美國的12個非綜合征型耳聾家系,在21例耳聾患者中檢出該致病同義突變,其中有20例為復合雜合突變,僅1例為純合突變[11]。gnomAD數(shù)據(jù)庫資料顯示,該突變在德系猶太人人群中頻率為0.4%(42/10 362),在東亞人群中頻率為0(0/19 536)。

黑色代表患者中檢出純合突變,藍色代表患者中檢出復合雜合突變,紫色代表患者中既有純合又有復合雜合突變,紅色五星代表與輕-中度聽覺表型相關突變

2.3MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)在CDGC數(shù)據(jù)庫耳聾及人群隊列中的致聾和攜帶情況 在CDGC耳聾隊列數(shù)據(jù)庫中,鑒定出MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)為耳聾致病突變的患者共5例,均為復合雜合致病。耳聾發(fā)病及確診在兒童時期,表現(xiàn)為重度-極重度感音神經(jīng)性聽力損失。2例患者民族不詳,2例為壯族,1例為回族。見表1。在CDGC人群隊列中,檢出3例聽力正常者攜帶此突變,均為廣西壯族人,該致病突變位點在廣西壯族人群中MAF為0.2%(3/1 438)。

表1 CDGC數(shù)據(jù)庫中MYO15A c.9861C>T致耳聾患者的基因型-表型情況

3 討論

3.1本研究通過一個中國遺傳性非綜合征型耳聾家系鑒定出MYO15A基因的高頻同義突變致病。該突變首次報道于2021年,為預防猶太遺傳病委員會、費城兒童醫(yī)院(Children′s Hospital of Philadelphia,CHOP)、愛荷華大學耳鼻喉科及腎臟分子研究中心(Molecular Otolaryngology and Renal Research Laboratories,MORL)等5個國際前沿遺傳和分子研究中心,通過多中心合作和數(shù)據(jù)共享成功鑒定為致病性突變[11]。該研究最初在預防猶太遺傳病委員會未明確遺傳病因的德系猶太人耳聾家系中,部分家系均檢出MYO15A基因的1個致病或可能致病的單雜合突變,尚不能解釋耳聾家系的致病原因。隨著多中心數(shù)據(jù)的共享和研究的深入,發(fā)現(xiàn)先前在生物信息學分析中,誤將MYO15A的高頻同義突變過濾掉,通過多中心數(shù)據(jù)整合、共分離分析和minigene功能驗證,證實了該同義突變的致病性。該同義突變在德系猶太人人群中頻率高達0.4%,高于ACMG/AMP指南中支持良性突變的BS1閾值(0.3%),且研究表明在該核苷酸水平上不具有進化保守性,故被誤認為良性可能大。值得注意的是,gnomAD數(shù)據(jù)庫顯示該位點在歐洲、東亞、南亞、拉丁美洲等多個地區(qū)的人群中頻率為0,唯獨在德系猶太人中頻率較高。在CDGC數(shù)據(jù)庫中,該突變在廣西壯族人群中的攜帶率也較高,在聽力正常者中檢出3例攜帶者。

3.2同義突變不會改變氨基酸序列,故大量同義突變是沒有生物學意義的,尤其是人群頻率較高的突變,往往會被當作良性突變而被過濾掉。然而,越來越多的研究表明事實并非如此,同義突變可通過多種機制引起疾病,包括影響剪切、mRNA結構和穩(wěn)定性、翻譯速率、蛋白構象和表達等過程[12-14],在某些情況下,還存在多種機制共同作用誘導疾病表型的可能[13]。其產(chǎn)生明顯生物學改變的最常見的方式是干擾前體mRNA剪接,可通過影響剪切增強子或沉默子元件功能,或產(chǎn)生隱匿性供/受體,導致編碼異常蛋白或產(chǎn)生不穩(wěn)定的異常mRNA。有研究報道,剪切增強子或沉默子元件中的同義變體也可通過改變某些mRNA亞型的相對豐度致病,如額顳葉癡呆和家族性生長激素缺乏[15-17]。通過患者的新鮮組織或細胞進行逆轉錄PCR可鑒定同義突變對剪切的影響,但臨床樣本的及時獲取往往受諸多因素的影響,這也刺激了其他實驗方法的發(fā)展,如minigene splicing assay。作為體內(nèi)剪切試驗驗證的替代技術,在體內(nèi)樣本獲取或基因表達量受限時,通過人為構建的minigene重組質(zhì)粒轉染目的細胞,經(jīng)逆轉錄PCR產(chǎn)物測序可直觀有效地驗證mRNA的剪接形式,在諸多疾病研究領域中表現(xiàn)卓越[18-19]。

3.3隨著“精準醫(yī)療”時代的到來和推進,建立基因型-表型精細化圖譜是遺傳性疾病進行精準預測、診斷、評估和干預的核心。自1995年在印度尼西亞巴厘島一村落的耳聾大家系中鑒定出MYO15A所致的ARNSHL后,大量的研究表明該基因突變所致的耳聾表型為先天性雙側全頻重度-極重度感音神經(jīng)性聾[20]。至2007年,Nal等[21]首次報道了MYO15A的N-末端突變可引起低頻有殘余聽力的非重度耳聾表型。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)肌球蛋白XVa有2個蛋白亞型,亞型2相較亞型1缺少由2號外顯子編碼的N-末端區(qū)域。因此,這種耳聾表型的差異取決于蛋白亞型2是否正常。隨后越來越多的研究證實這一論點,發(fā)生在N-末端區(qū)域的突變[如MYO15A(p.Tyr289X)、(p.Glu396Argfs*36)、(p.Ser1176Valfs*14)[22]等]仍擁有正常的亞型2,聽力表型為低頻區(qū)有殘余聽力的感音神經(jīng)性聾。而非N-末端區(qū)域(如Motor、MyTH4 1、FERM1、SH3、MyTH4 2、FERM2及PDZ結構域)發(fā)生的突變導致蛋白亞型1和2均異常,聽力表型多為先天性雙側重度-極重度感音神經(jīng)性聾[23]。本研究報道的MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)位于61號外顯子中段區(qū)域,編碼FERM2結構域。該突變在本研究中所致的耳聾表型為兒童時期的重度-極重度聽力損失,Hirsch等[11]在首次報道中總結,大部分患者經(jīng)新生兒聽力篩查,診斷為遲發(fā)性進展性耳聾,通過minigene驗證闡明其致病機制為該同義突變所致的整個61號外顯子跳躍,因此從本質(zhì)上說它是一個剪切位點的突變。本研究還總結了FERM2結構域附近的所有已報道的截斷突變的基因型-表型情況,包括影響剪切突變10個:c.8968-1G>C,c.8968-1G>T,c.9083+6T>A,c.9229+1G>A,c.9229+2T>C,c.9518-2A>G,c.9611_9612+8del,c.9690+1G>A,c.9861C>T,c.9948G>A;移碼突變4個:c.9316dup,c.9958_9961del,c.9995_10002dup,c.10573del;無義突變4個:c.9319G>T,c.9514C>T,c.9790C>T,c.10474C>T。其中以純合突變致病為主,大部分致病位點均表現(xiàn)為雙側重度-極重度語前聾,僅2個位點表現(xiàn)為非重度進展性耳聾(c.9790C>T,c.9861C>T),它們分別為無義突變和影響剪切的同義突變,且均有復合雜合的致病報道。另外,2014年在巴基斯坦一ARNSHL家系中,通過minigene驗證后鑒定出位于61號外顯子最后一個氨基酸的同義突變MYO15ANM_016239.4:c.9948G>A(p.Gln3316=)[24],同樣也會導致61號外顯子的跳躍,其耳聾表型為先天性重度-極重度耳聾。因此相同突變致聾的患者仍可表現(xiàn)為不同表型,可能為種族間不同遺傳背景的基因修飾作用,也不排除與其復合雜合的另一位點功能喪失效應不同所致,可通過全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)、轉錄組測序(RNA-sequencing,RNA-Seq)及細胞和動物實驗進一步探究。

綜上,本研究確定了MYO15A基因的一個同義突變在中國人群的致病性,可導致早發(fā)的重度-極重度耳聾。該位點在中國廣西壯族及德系猶太人人群中攜帶率相對較高。對于這種在某些地區(qū)富集較明顯的位點,過濾分析時應格外注意,高頻與同義突變并非過濾的絕對指標。