王李寶　黎慧　于志君　史文軍　馮衛(wèi)　趙然　沈輝　成婕　管小平　秦亞兵　萬夕和

摘要： 為評估微流控芯片法在蝦肝腸胞蟲（EHP）、致急性肝胰腺壞死病副溶血性弧菌（VpAHPND）、十足目虹彩病毒1（DIV1）和白斑綜合征病毒（WSSV）4種南美白對蝦常見病原聯(lián)檢中的各項性能，設(shè)計針對上述4種病原擴增反應(yīng)的引物，對已有芯片進行新的功能劃分，同時優(yōu)化該基因芯片的反應(yīng)體系及恒溫擴增條件。結(jié)果表明，優(yōu)化的聯(lián)檢方法可同時檢測上述4種病原，特異性好，30 min反應(yīng)時間即可給出病原聯(lián)檢結(jié)果。EHP、 DIV1、WSSV、VpAHPND指標檢出限分別為1 μl 0.57拷貝、0.43拷貝、2.12拷貝 、3.18拷貝，已達到甚至超過了環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）檢測的靈敏性。本次測試中的南美白對蝦4種病原微流控芯片聯(lián)檢方法所用的檢測試劑盒具有操作簡便、檢測靈敏、特異性強、檢測時間短、設(shè)備要求簡單等特點，適合整個養(yǎng)殖過程中對南美白對蝦EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV的監(jiān)測與篩查工作。

關(guān)鍵詞： 南美白對蝦；病原；微流控芯片；聯(lián)檢

中圖分類號： S945.4 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0471-08

Testing of microfluidic chip for joint detection of four common pathogens of Litopenaeus vannamei

WANG Li-bao¹， LI Hui¹， YU Zhi-jun^1，2， SHI Wen-jun¹， FENG Wei¹， ZHAO Ran^1，2， SHEN Hui¹， CHENG Jie¹， GUAN Xiao-ping³， QIN Ya-bing⁴， WAN Xi-he¹

（1.Jiangsu Institute of Oceanology and Marine Fisheries， Nantong 226007 China;2.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China;3.Yili Yueran Ecological Agriculture Co.， Ltd. Yili? 835300， China;4.Comprehensive Service Center of Dayu Town， Rudong County， Nantong 226412， China）

Abstract： To evaluate the performance of microfluidic chip method in the joint detection of four common pathogens of Litopenaeus vannamei including Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）， acute hepatopancreas necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus （VpAHPND）， Decapod iridescent virus 1 （DIV1） and white spot syndrome virus （WSSV）， primers for the amplification reactions of the above four pathogens were designed， new functional divisions were made for the existing chips， and the reaction system and constant temperature amplification conditions of the microfluidic chip were optimized. The results showed that， the optimized combined detection method could detect the above four pathogens simultaneously with good specificity， and the joint detection results could be obtained within 30 min reaction time. The detection limits of EHP， DIV1， WSSV and VpAHPND were 0.57 copies/μl， 0.43 copies/μl， 2.12 copies/μl and 3.18 copies/μl， respectively. Some of the limits had reached or even exceeded the testing sensitivity of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） method. The detection kit used in the joint detection method of microfluidic chip for the four pathogens of L. vannamei in this test is characterized by simple operation， sensitive detection， strong specificity， short detection time and simple equipment requirements， and is suitable for the monitoring and screening of EHP， VpAHPND， DIV1 and WSSV of L. vannamei in the whole breeding process.

Key words： Litopenaeus vannamei;pathogens;microfluidic chip;joint detection

病害對南美白對蝦養(yǎng)殖業(yè)的影響與臺風、洪澇等自然災(zāi)害產(chǎn)生的影響不相上下^[1]。對蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）、對蝦急性肝胰腺壞死病副溶血性弧菌（AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus，VpAHPND）、十足目虹彩病毒1（Decapod iridescent virus 1，DIV1）和白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）等病原成為許多地區(qū)對蝦大批量死亡或生長延滯的主要原因之一^[2]。簡化傳統(tǒng)分子檢測過程中繁瑣的樣品處理程序和擴增步驟，研發(fā)采樣現(xiàn)場適用的便攜式分析儀器及配套試劑，實現(xiàn)現(xiàn)場快速即時檢測（Point-of-care testing，POCT）是當務(wù)之急。該聯(lián)檢方法的研發(fā)，將為在養(yǎng)殖各個環(huán)節(jié)實時監(jiān)控病原體的攜帶情況，并有效防控擴散、減少經(jīng)濟損失提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

微流控芯片技術(shù)（Microfluidic chip technology）是人們?yōu)榱藢悠非疤幚?、分離及檢測等過程集成到數(shù)平方厘米的芯片上，利用芯片內(nèi)部流體完成微升/納升級別的體系反應(yīng)，最終實現(xiàn)后續(xù)分析的自動化、微型化、集成化的一種追求極致的方法技術(shù)^[3-5]。該技術(shù)誕生至今因其反應(yīng)體系固有的微量化、集約化等優(yōu)勢，應(yīng)用領(lǐng)域早已遍及醫(yī)學、生命科學和化學等學科和領(lǐng)域^[6-8]。微流控芯片技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用仍停留在水產(chǎn)致病菌和養(yǎng)殖水體關(guān)鍵環(huán)境因子的檢測層面^[9-11]，針對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原，尤其是對蝦常見病毒性和寄生蟲性病原的微流控芯片技術(shù)應(yīng)用尚未有相關(guān)報道。

目前對蝦常見病原體檢測仍沿用國家標準或行業(yè)標準中的PCR法或巢式PCR（Nested PCR）法，但PCR法的靈敏度不高^[12]，巢式PCR的操作步驟較為繁瑣，檢測指標相對單一，且易受到環(huán)境氣溶膠的污染^[13-15]。熒光定量PCR法在核酸提取過程中無法進行質(zhì)量控制，且熔解曲線易干擾多指標聯(lián)檢的檢測結(jié)果^[16]。與檢測成本最高的多通道熒光定量PCR法相比，熒光定量PCR法無法同時檢測4個以上病原體指標^[17-18]，不利于大規(guī)模普及。本研究擬設(shè)計針對EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV的特異性引物，構(gòu)建微流控芯片與環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）相結(jié)合的檢測體系，完善一種高效、快速、準確并適應(yīng)現(xiàn)場檢測的針對上述4種病原的聯(lián)檢方法。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

快速吸附柱法DNA提取試劑盒為寧波愛基因科技有限公司產(chǎn)品，型號：ZMTQ002；對蝦微流控芯片4聯(lián)檢快速檢測試劑盒由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所獨立研發(fā)；微流控恒溫擴增儀為寧波愛基因科技有限公司產(chǎn)品，型號：MA2000E。

1.2 樣品

含有EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV病原體的對蝦組織樣本由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所生物技術(shù)研究室保存，無病原體的健康對蝦組織樣本從南通當?shù)孬@取。病原體的對蝦組織樣本經(jīng)過國家標準方法 《白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測法》（GB/T 28630.2-2012）^[19]、地方標準《南美白對蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測方法》（DB32/T 3802-2020）^[20]或世界動物衛(wèi)生組織（OIE）和亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)（NACA）推薦方法檢測為陽性；無病原體的健康對蝦組織經(jīng)上述檢測方法檢測為陰性。同時采集江蘇省省內(nèi)的南美白對蝦仔蝦樣品（85份）和成蝦樣品（100份）進行實測樣本驗證試驗。

1.3 病原DNA提取

樣本DNA模板提取方法與步驟參照《快速吸附柱法DNA抽提試劑盒的產(chǎn)品說明書》。仔蝦取頭胸部組織提取DNA，成蝦取鰓和肝胰腺組織混樣提取DNA。

1.4 微流控芯片聯(lián)檢方法的建立和結(jié)果判定

本研究設(shè)計針對上述4種病原體擴增的特異性引物（表1），將其預埋至微流控芯片對應(yīng)的反應(yīng)池孔內(nèi)。

芯片含8個加樣孔和32個反應(yīng)池，均勻分布于4個獨立單元。加樣孔和反應(yīng)池通過毛細管相連，反應(yīng)池彼此互不相通。將提取的DNA模板和反應(yīng)液混勻后注入加樣孔，用配套的封口膜封閉微流控芯片，利用離心力驅(qū)動反應(yīng)液分別均勻地注入反應(yīng)池（圖1）。

用微流控恒溫擴增儀對封裝好的微流控芯片進行恒溫擴增，讀取反應(yīng)后的實時熒光數(shù)值和循環(huán)閾值（Ct值），進行結(jié)果判定。30 min內(nèi)，待檢樣品出現(xiàn)特異性S形擴增曲線，且Ct值<30時判定為陽性結(jié)果；30 min內(nèi)，待測樣品未擴增出特異性曲線，且Ct值<30時判定為陰性結(jié)果。

1.5 特異性試驗

將上述4種病原的陽性樣品提取的DNA模板作為反應(yīng)液模板，并設(shè)定陰性對照組，利用微流控芯片恒溫擴增儀進行反應(yīng)，考察在同一個擴增程序中能否同步特異性地擴增出4種擴增曲線。

1.6 靈敏度和檢出限

選擇已經(jīng)確定含有EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV病原體的對蝦組織樣本，按照方法1.3中所述DNA提取方法，提取樣本中DNA作為后續(xù)靈敏度和檢出限試驗的模板。經(jīng)實時熒光定量PCR（Real time fluorescent quantitative PCR，RT-FQ PCR）法確定DNA模板中的目標病原拷貝濃度，并以此已知濃度DNA模板作為靈敏度和檢出限測試測驗的初始樣本，通過對該樣本進行10倍梯度稀釋以進行下一步靈敏度和檢出限測試試驗，同時設(shè)立陰性空白對照組。以出現(xiàn)特異性擴增曲線的最低稀釋濃度的DNA模板中對應(yīng)病原的拷貝濃度作為最終靈敏度和檢出限的結(jié)果。

1.7 重復性

按照方法1.3的方法準備4種病原陽性樣品，同時設(shè)立陰性對照組，對每種陽性樣品進行8次測定，以8次樣品測定Ct值的變異系數(shù)（CV）來評估本檢測體系的重復性^[21]。

1.8 實測樣本驗證

采集江蘇省省內(nèi)南美白對蝦仔蝦樣品85份和成蝦樣品100份，進行微流控芯片法與傳統(tǒng)PCR方法檢測的結(jié)果對比試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 聯(lián)檢方法的建立

通過反復優(yōu)化試驗條件[包括Mg²⁺濃度，正反向引物比例和納米金顆粒（Gold nanoparticles，AuNPs）種類、粒徑和濃度等]確定了每個反應(yīng)池5.0 μl 恒溫擴增反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系中各組分組成如下：20 mmol/L Tris-HCl 0.1 μl，20 mmol/L KCl 0.8 μl，40 mmol/L （NH₄）₂SO₄0.3 μl，40 mmol/L MgSO₄0.3 μl，2.8 mmol/L dNTPs 0.3 μl，8 000 U/ml DNA聚合酶0.2 μl，50 μmol/L SYBR Green熒光染料 0.2 μl，8×10^-6mol/L Na₃Ct- AuNPs（檸檬酸三鈉-納米金） 0.4 μl，ddH₂O 0.4 μl，測試樣品DNA模板 1.0 μl。引物濃度均為 50 μmol/L，各0.5 μl，以凍干粉形式提前預埋到反應(yīng)池內(nèi)。隨后63.5 ℃恒溫擴增30 min。在圖1樣品加樣孔位置，加入總反應(yīng)預混液（15.0 μl熒光預混液和10.0 μl核酸模板）。初步混勻后，用配套的封口膜封閉微流控芯片，將微流控芯片安裝入微流控恒溫擴增儀，1 500 r/min離心3 min，5 000 r/min離心3 min，將反應(yīng)液均勻分布到各個反應(yīng)池中，隨后63.5 ℃恒溫擴增30 min。如圖2所示，陽性對照樣品30 min內(nèi)相應(yīng)的反應(yīng)孔出現(xiàn)典型的擴增曲線，且Ct<30；陰性對照相應(yīng)的反應(yīng)孔未出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct<30。

2.2 檢測結(jié)果特異性

根據(jù)上述反應(yīng)體系和恒溫擴增程序，將提取的4種對蝦病原陽性樣品DNA模板按照圖1中樣品分布孔進行上樣分析，在30 min內(nèi)能在不同的時間點出現(xiàn)特異性的擴增曲線并加以區(qū)分（圖3）。

本檢測體系在同一恒溫擴增條件下，對上述4種病原在30 min內(nèi)均能實現(xiàn)特異性的有效檢出，但針對每一種病原檢測具體的靈敏度和檢測限還需要進一步試驗來驗證。

2.3 檢測結(jié)果靈敏度和檢出限

用已經(jīng)確定含有EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV病原體的對蝦組織樣本參照方法1.3提取試驗用DNA模板，經(jīng)實時熒光定量PCR方法確定DNA模板中的EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV 4種目標病原拷貝數(shù)分別為1 μl 5 736拷貝、3 183拷貝、4 327拷貝和2 117拷貝。將該溶液進行10倍梯度稀釋作為靈敏度和檢出限的樣品，同時設(shè)立陰性空白對照組。

根據(jù)最低稀釋倍數(shù)下出現(xiàn)特異性擴增曲線的DNA含量來確定本檢測方法針對每種病原檢測指標的靈敏度和檢出限。結(jié)果（圖4）顯示，4種病原檢測指標中DIV1原液出現(xiàn)特異性擴增曲線的時間點最早，但隨著陽性樣本含量的降低，其特征擴增曲線出現(xiàn)時間會延遲直至消失。

其余病原檢測靈敏度和檢出限試驗結(jié)果都呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，根據(jù)出現(xiàn)典型陽性擴增曲線的最大陽性樣本稀釋倍數(shù)，最終本檢測方法中VpAHPND、WSSV、EHP和DIV1 4種病原聯(lián)檢的檢出限依次為：1 μl 3.18拷貝、2.12拷貝、0.57拷貝和0.43拷貝。結(jié)果顯示，本檢測方法對于EHP和DIV1的檢測較為靈敏，并可通過進一步優(yōu)化反應(yīng)體系和條件來提升WSSV和VpAHPND檢測的靈敏度。

微流控芯片法對EHP的檢出限要低于傳統(tǒng)PCR方法，據(jù)報道傳統(tǒng)PCR方法檢出限為1 μl 3.30拷貝^[22]。而微流控芯片法對VpAHPND的檢出限又高于傳統(tǒng)PCR方法，據(jù)報道用傳統(tǒng)PCR方法的檢出限為1 μl 0.32拷貝^[22]。其他2種病原PCR法的檢出限暫未見報道。

2.4 檢測結(jié)果重復性

為了評估本檢測體系的重復性，選擇已經(jīng)確定為病原陽性的樣品提取DNA模板，并設(shè)立陰性對照，對陽性樣品進行8次測定，4種病原陽性樣品測定的Ct值的CV值為2.22%～3.47%（表2），均≤5.00%，具有較好的重復性。

2.5 微流控芯片法與PCR方法檢測結(jié)果的對比

如表3所示，利用微流控芯片法與傳統(tǒng)PCR法蝦肝腸胞蟲（EHP）、對蝦急性肝胰腺壞死病副溶血性弧菌（VpAHPND）、十足目虹彩病毒1（DIV1）、白斑綜合征病毒（WSSV）的循環(huán)閾值（Ct值）的變異系數(shù)分別為3.18%、3.47%、2.55%、2.22%。

檢測成蝦樣品100份，蝦苗樣品85份，在成蝦樣品中4種病原的微流控芯片法檢測結(jié)果與傳統(tǒng)PCR法檢測結(jié)果保持了高度的一致性；而蝦苗樣品中，分別使用微流控芯片法與傳統(tǒng)PCR法檢測，微流控芯片法陽性檢出率略低于傳統(tǒng)PCR法。對比兩者從DNA模板提取開始到完成4種病原檢測所用時間，微流控芯片法（用時1 h）要比傳統(tǒng)PCR法（用時6 h）節(jié)約近5 h。

3 討論

20世紀90年代初，微流控芯片技術(shù)首次被報道^[3]，這一技術(shù)在微米尺度芯片上實現(xiàn)了制備、反應(yīng)、分離和檢測等基本操作單元的功能集成，在短時間內(nèi)完成上百個樣品的平行自動分析，滿足現(xiàn)場快速即時檢測的需求^[23-24]。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，至今已衍生出解旋酶依賴性擴增（HDA）微流控芯片、碟式微流控芯片、POC微流控芯片、數(shù)字微流控芯片、卡式微流控芯片等多種微流控芯片^[25-27]。由于微流控芯片法自身具有微型化、集成化和自動化等特點，以及消耗樣品和試劑量少、反應(yīng)迅速、可大量平行處理等優(yōu)點，該項技術(shù)在生物學、醫(yī)學、化學和免疫學等領(lǐng)域表現(xiàn)出無限的發(fā)展?jié)摿?sup>[28^-31]。微流控芯片的應(yīng)用范圍從單純的基因擴增與分析^[32]拓展到了細胞培養(yǎng)^[33]、蛋白質(zhì)檢測^[34]和特征化合物分析^[35]等領(lǐng)域。

本病原檢測體系是基于微流控芯片與LAMP技術(shù)相結(jié)合的一種新型檢測技術(shù)，具有傳統(tǒng)LAMP技術(shù)所具有的步驟簡單、反應(yīng)時間短、特異性和靈敏度高^[36-37]、不需要特殊儀器等特點^[38]，除了可以用于突發(fā)水產(chǎn)疫情的POCT外^[39]，還可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖日常管理關(guān)鍵時期的病原實時監(jiān)控。在試驗前期本檢測體系利用2對特異性恒溫擴增引物，并選擇檸檬酸三鈉-納米金（Na₃Ct- AuNPs）作為提升恒溫擴增效率和特異性的輔助劑^[40]，通過優(yōu)化恒溫擴增體系和擴增溫度，4種常見病原在本次微流控芯片聯(lián)檢方法中均出現(xiàn)了特征性擴增，且該檢測方法檢測限除了 VpAHPND指標外，其他3項指標的最低檢測限已經(jīng)處于較為領(lǐng)先的水平^[41-42]，可與目前應(yīng)用較廣的Nested PCR ^[43]和RT-FQ PCR ^[44]、數(shù)字PCR（Digital PCR）和等溫聚合酶擴增技術(shù)（RPA）等相媲美^[45-46]。本檢測方法中所用的試劑、儀器、芯片等均享有國內(nèi)自主知識產(chǎn)權(quán)，可以自主化生產(chǎn)，能有效避免國際專利間的技術(shù)糾紛，具備良好的適用性和市場價值。

本檢測方法在檢測結(jié)果的重復性和穩(wěn)定性上優(yōu)勢顯著。已有的國家標準方法或者是OIE/NACA推薦的經(jīng)典PCR方法，尤其是多重PCR（Multiplex PCR）和Nested PCR方法，仍可能產(chǎn)生非特異性擴增，從而影響最終的結(jié)果判定。其中氣溶膠污染是產(chǎn)生假陽性擴增的主要原因^[47]，而本聯(lián)檢體系始終在一個相對密閉的環(huán)境中進行目的基因序列的恒溫擴增，有效降低了氣溶膠污染的概率，增強了聯(lián)檢體系的可靠性和穩(wěn)定性。在本檢測方法建立時，檢測全程加入4種病原指標的陽性樣本用于全程質(zhì)量控制，既驗證了本檢測方法中核酸提取試劑盒的有效性，又進一步驗證了后續(xù)微流控恒溫擴增和病原結(jié)果研判的有效性。本檢測方法不僅適用于養(yǎng)殖塘口對蝦常見病原的POCT，還為對蝦大型養(yǎng)殖企業(yè)全程監(jiān)控養(yǎng)殖病害發(fā)生提供了技術(shù)支持，這為有效預警并控制對蝦養(yǎng)殖病害的發(fā)生提供了經(jīng)濟、便捷、快速和有效的手段，同時對中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展起到了保駕護航的重要作用。

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（責任編輯：陳海霞）