時金蒙 張會芳 郝振莉

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開封 475004）

0 前言

STED 超分辨率顯微鏡已被廣泛應(yīng)用于大氣水體環(huán)境物質(zhì)檢測、生理病理檢測以及生物制劑研制與生產(chǎn)等領(lǐng)域，具有分辨率高、聚焦能力強(qiáng)等優(yōu)點[1]。對傳統(tǒng)的顯微成像效果影響因素的研究較為成熟，對STED 超分辨率顯微成像影響因素的研究還有較大的提升空間[2]。當(dāng)前，很多使用者片面認(rèn)為數(shù)值孔徑越大，STED 超分辨率顯微鏡的成像效果一定就越好[3]，未進(jìn)行更深入的定量定性分析。實際情況并非完全如此，因此，研究高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

該文按照從理論到實際的思路，分別對STED 超分辨率顯微鏡的原理、作用以及不同評價指標(biāo)等進(jìn)行闡述，從有利影響、不利影響2 個方面論述了高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響，并提出了一種新穎的定量確定高數(shù)值孔徑的算法。

1 STED 超分辨率顯微成像

受激輻射損耗（STED）對設(shè)備要求相對較高，可以實時拍攝且成像速度快，醫(yī)學(xué)實踐中常用于活細(xì)胞成像追蹤與檢測。

1.1 STED 超分辨率顯微成像的原理和作用

STED 顯微技術(shù)作為第一個突破光學(xué)衍射極限的遠(yuǎn)場顯微成像技術(shù)，其基本原理是采用2 束激光同時照射樣品，其中一束激光用來激發(fā)熒光分子，使物鏡焦點艾里斑范圍內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)；同時，用另外一束中心光強(qiáng)為0 cd的環(huán)形損耗激光與其疊加，使物鏡焦點艾里斑邊沿區(qū)域處于激發(fā)態(tài)的熒光分子通過受激輻射損耗過程返回基態(tài)而不自發(fā)輻射熒光，因此只有中心區(qū)域的熒光分子可以自發(fā)輻射熒光，從而獲得超衍射極限的熒光發(fā)光點。

1.2 STED 超分辨率顯微成像的評價指標(biāo)

STED 超分辨率顯微成像技術(shù)有多項評價指標(biāo)，一般是針對物鏡的。

1.2.1 分辨率

顯微鏡的分辨率是最核心的指標(biāo)，它是指能夠清晰區(qū)分2 個物點的最小間距，在有些場合又被稱為鑒別率。物鏡的分辨率與光線波長成正比，與數(shù)值孔徑成反比。由于在現(xiàn)實中選擇不同波長光線的可能性不大，因此數(shù)值孔徑成為影響分辨率的唯一因素。

1.2.2 焦深

焦深就是焦點深度，是指當(dāng)用物鏡進(jìn)行對焦時，在焦點上、下延伸一定范圍，在這個范圍內(nèi)也是完全意義上的清晰區(qū)域，這個延伸范圍的高度就是焦深。焦深概念引入的最大意義就是方便對所觀測物體立體成像清晰度進(jìn)行定量分析和評價[4]。

1.2.3 景深

當(dāng)使用物鏡進(jìn)行對焦時，除了在焦點的上、下進(jìn)行延伸以外，也可以在左、右部分延伸，左、右清洗區(qū)的長度即為景深。通俗來說，景深表示焦點左、右可以延伸到的清晰觀測范圍，這個清晰度不隨圖像的變大而變化[5]。

1.2.4 放大率和有效放大率

放大率是指顯微成像的大小與被觀測物質(zhì)實際大小的比值，實踐中一般等于目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積。由于受到實踐中各種條件的制約，一般達(dá)不到理論放大倍數(shù)，顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。

1.2.5 覆蓋率

由于顯微鏡蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了變化，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。國際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17 mm，許可范圍為0.16 mm～0.18 mm[6]。

1.2.6 視場直徑

由于目鏡是圓筒狀的，因此檢測員通過目鏡觀測的物質(zhì)成像也是圓形背景，大小由目鏡里的視場光闌決定。這個圓形背景的直徑被稱為視場直徑，是表征肉眼能夠觀察到的范圍大小的量值。視場直徑的計算公式為視場直徑=目鏡視場數(shù)/物鏡倍率。

2 高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響

STED 超分辨率顯微成像器械繼承了傳統(tǒng)顯微鏡的一般原理，因此在高數(shù)值孔徑下具有許多優(yōu)勢。

2.1 數(shù)值孔徑與顯微成像的關(guān)系

顯微鏡結(jié)構(gòu)及成像原理如圖1 所示（195 mm 的物象距離是我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的）。

圖1 顯微鏡結(jié)構(gòu)及成像原理示意圖

對物體的放大倍數(shù)取決于目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積，對顯微鏡來說，目鏡放大倍數(shù)是根據(jù)需要由調(diào)節(jié)旋鈕進(jìn)行自動調(diào)節(jié)的，而物鏡放大倍數(shù)需要根據(jù)不同數(shù)值孔徑的選擇進(jìn)行調(diào)整。通常情況下，數(shù)值孔徑越大，物鏡放大倍數(shù)越高，相應(yīng)的顯微鏡整體放大倍數(shù)也越高。

數(shù)值孔徑NA是透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率n和孔徑角2α半數(shù)的正弦的乘積，如公式（1）所示。孔徑角又稱鏡口角，是透鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。

2.2 高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的正面影響

2.2.1 分辨率與數(shù)值孔徑之間基本上呈正相關(guān)

對傳統(tǒng)光學(xué)成像顯微鏡來說，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高，在目鏡中顯示的物體形象就越清晰。對STED 超分辨率顯微鏡來說，被螺旋相位板整形的激光束經(jīng)過高數(shù)值孔徑透鏡聚焦后，數(shù)值孔徑會影響損耗光聚焦光斑的光強(qiáng)分布。不同的數(shù)值孔徑會對損耗光聚焦光斑光強(qiáng)分布和半高寬度造成不同的影響，隨著數(shù)值孔徑的增大，半高寬度逐漸變小，最后趨于飽和。一般來說，當(dāng)數(shù)值孔徑增大時，STED 顯微鏡的分辨率會提高，但是不能證明數(shù)值孔徑越大，STED 顯微鏡的分辨率就越大。

由于STED 顯微鏡分辨率與受激光照光強(qiáng)有統(tǒng)計學(xué)意義，而光強(qiáng)大小直接與損耗光聚焦光斑半高寬有統(tǒng)計學(xué)意義[7]，因此在模擬試驗中，通過設(shè)置不同的數(shù)值孔徑來比較數(shù)值孔徑和損耗光聚焦光斑的半高寬之間的關(guān)系，該文計算了8 個不同數(shù)值孔徑對應(yīng)的半高寬度，結(jié)果見表1。

對STED 超分辨率顯微鏡來說，數(shù)值孔徑突破了光的衍射限制，最高可以達(dá)到1.4 mm，由于該文研究的是高數(shù)值孔徑下STED 超分辨率顯微成像技術(shù)的影響，因此最低設(shè)定在普通顯微鏡數(shù)值孔徑較大區(qū)間的起始點0.7 mm。對數(shù)值孔徑在0.7 mm 以下的情況來說，該文的研究對其意義不大，因此表1 中未列出相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.2.2 高數(shù)值孔徑下STED 超分辨率顯微成像視野更寬闊

光線顯示的波狀延伸效果被稱為衍射。這就是為什么即便是使用無像差的高效能鏡頭也會以圓盤形狀的圖樣延伸而不是在單點匯聚。數(shù)值孔徑指示沒有光學(xué)像差的鏡頭的聚光限制或衍射限制，這個概念被認(rèn)為來自光的波狀表現(xiàn)。這種圓盤形狀的波稱為愛裏斑（Airy Disk）[8]。愛裏斑（Airy Disk） 的半徑r（寬度）如公式（2）所示。

式中：λ為光的波長；NA為數(shù)值孔徑。

通過公式（2）得出的值稱為解析度。數(shù)值孔徑越大，愛裏斑 （Airy Disk） 的半徑就越??；這表明數(shù)值孔徑越大，影像就越清晰，這也是評估鏡頭的通用標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的不利影響分析

在高數(shù)值孔徑為STED 超分辨率顯微成像帶來很多益處的同時，也會產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。

2.3.1 數(shù)值孔徑過高

數(shù)值孔徑過高會出現(xiàn)焦深和景深過小的現(xiàn)象。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)一樣，STED 超分辨率顯微成像技術(shù)的焦深與數(shù)值孔徑的平方成反比，數(shù)值孔徑越大，焦深越小。焦深小，允許的模糊圈就小，需要在實際檢測與拍攝過程中物距（攝距）減少，鏡頭焦距變短，光圈變大，會影響物體的觀測、拍攝范圍。焦深大， 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的1 個薄層。

雖然景深與焦深是不同的概念，但是數(shù)值孔徑越大，景深也越小。一般來說，景深與焦深是呈正相關(guān)的，但是景深并不是越大越好。因為低倍物鏡的景深較大，所以當(dāng)?shù)捅段镧R照相時會面臨困難。由于STED 超分辨率顯微鏡一半都具有較大的放大倍數(shù)，因此在其工作范圍內(nèi)，景深過小不利于細(xì)微圖像的鑒別。

圖2 中焦深為點B與點C連線，景深為點B'與點C'連線。雖然焦深和景深所代表的意義完全不同，但是可以通俗的理解為焦點實際上不是一個點，而是一個矩形區(qū)域范圍，其中矩形的長度為景深，矩形的高度為焦深，兩者都是表征焦點區(qū)域范圍大小的重要指標(biāo)。

圖2 同一圖像焦深和景深位置關(guān)系示意圖

如果不同焦深和景深的圖像不需要進(jìn)行放大后觀察很小范圍內(nèi)的圖像具體效果，那么基本上沒有太大區(qū)別，如果需要放大一定倍數(shù)，那么圖像放大后的顯示質(zhì)量會存在明顯的差異。以南加利福尼亞大學(xué)圖像庫的狒狒圖像為例，放大相同倍數(shù)后，所產(chǎn)生的變化具體如圖3 所示。

圖3 不同焦深和景深情況圖像baboon 對比示意圖

圖3 是將焦深和景深不同的512×512 八位灰度圖像baboon 在MATLAB 軟件中放大3 倍之后的顯示效果，圖片格式均為JPG。圖3（a）的焦深和景深較大，圖3（b）的焦深和景深較小，通過肉眼可以明顯看到圖3（a）比圖3（b）更清晰。具體到顯微成像中，當(dāng)需要觀察很小區(qū)域圖像的具體細(xì)節(jié)時，需要通過調(diào)節(jié)目鏡旋鈕放大倍數(shù)進(jìn)行觀看，因此需要更大的焦深和景深，此時如果數(shù)值孔徑過大，反而不利于提高觀測精度。

2.3.2 高數(shù)值孔徑處在一定區(qū)間內(nèi)

高數(shù)值孔徑處在一定區(qū)間內(nèi)會導(dǎo)致受激輻射光強(qiáng)下降。從理論上來說，由于STED 損耗光為環(huán)狀光束且其中心強(qiáng)度為0 cd，因此環(huán)狀損耗光越強(qiáng)，由第一束激發(fā)光激發(fā)的熒光分子所占的區(qū)域就越小，其橫向分辨率就越高。根據(jù)第2.1 節(jié)的分析可知，當(dāng)數(shù)值孔徑為0.7 mm～1.1 mm 時，損耗光半高寬度變窄，受激輻射光強(qiáng)下降的影響，光的通透力變?nèi)?，造成在此區(qū)間內(nèi)分辨率降低，同時三維層析能力降低。根據(jù)第3.1 節(jié)的分析可知，顯微成像技術(shù)的焦深景深不斷減少，當(dāng)需要精準(zhǔn)觀測某一較小范圍內(nèi)的情況且需要對所要觀測的圖像進(jìn)行放大時，會出現(xiàn)圖像模糊不清的情況。另外，由于數(shù)值孔徑的變大會導(dǎo)致觀測者必須將物距變小，因此工作距離也相應(yīng)縮短。綜上所述，高數(shù)值孔徑給視場寬度和工作距離帶來了一定的負(fù)面影響。

3 基于遺傳算法的高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的效果優(yōu)化

3.1 遺傳算法適用性分析

根據(jù)第2 節(jié)的分析可知，高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像具有有利影響和不利影響。在當(dāng)前國內(nèi)外的研究中多采用定性分析，缺乏定量分析，究竟數(shù)值孔徑為多大時能夠達(dá)到最好的綜合效果，需要根據(jù)建立模型使用優(yōu)化算法進(jìn)行局部尋優(yōu)與全局尋優(yōu)，最終達(dá)到收斂的效果，以此確定的自變量值就是數(shù)值孔徑具體的取值。實際中常用的優(yōu)化算法包括遺傳算法、粒子群算法、蟻群算法以及模擬退火算法等，該文以遺傳算法為例，將高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的分析由定性拓展到定量層面。

遺傳算法包括3 個基本操作，分別是選擇、交叉和變異。選擇是指在進(jìn)化的每代中，根據(jù)適應(yīng)度函數(shù)計算個體的適應(yīng)度，選擇最佳個體及其代表的解。交叉是為了避免出現(xiàn)“早熟”現(xiàn)象，事先確定一個較小概率，每代中使用偽隨機(jī)數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生一個隨機(jī)數(shù)，當(dāng)隨機(jī)數(shù)小于交叉概率時，對2個個體編碼進(jìn)行交叉操作（隨機(jī)選取交叉位）。變異是根據(jù)變異概率隨機(jī)反轉(zhuǎn)某一位的二進(jìn)制值，一般選取的變異概率要明顯小于交叉概率，其原因是如果變異概率很大，算法就類似于獨(dú)立的隨機(jī)算法，失去了遺傳尋優(yōu)的意義。

3.2 算法的設(shè)計和實現(xiàn)

3.2.1 確定適應(yīng)度函數(shù)

確定適應(yīng)度函數(shù)的整體思路是兼顧第2.2 節(jié)的有利影響和第2.3 節(jié)的不利影響，因此應(yīng)是2 個函數(shù)的和。由于是研究數(shù)值孔徑對成像的影響，因此自變量只有1 個值，代表STED 高分辨率顯微成像設(shè)備的數(shù)值孔徑寬度或者叫做直徑（用d來表示）。第一個函數(shù)是adv（d），其中又包括2 個小函數(shù)s（d）和r（d），分別代表分辨率和視野寬度隨數(shù)值孔徑的變化曲線，合起來代表有利影響。第二個函數(shù)是disadv（d），其中又包括3 個小函數(shù)x（d）、y（d）和z（d），分別代表焦深、景深和激光輻射光強(qiáng)隨數(shù)值孔徑變化的曲線，合起來代表不利影響。實踐中根據(jù)不同的應(yīng)用需求來確定每個分函數(shù)對應(yīng)的不同權(quán)值。因此適應(yīng)度函數(shù)如公式（3）所示。

式中：?1～?5為5 個不同的權(quán)值。。

3.2.2 確定步長及權(quán)值每個分函數(shù)的數(shù)值

隨數(shù)值孔徑的變化不是簡單的線性關(guān)系，甚至不是單調(diào)關(guān)系，因此無法簡單計算得出最優(yōu)解。通過確定合適步長，使自變量d在較大量數(shù)值之間進(jìn)行變化，通過不斷的確定局部最優(yōu)解來不斷逼近全局最優(yōu)解。隨著納米科技的不斷發(fā)展和成熟應(yīng)用，理論上該算法可以達(dá)到納米級別，即計算最優(yōu)解的結(jié)果精確到納米。但實際考慮到顯微成像設(shè)備制造技術(shù)尚未達(dá)到納米級別且必須為算法效率考慮，盡量降低在普通計算機(jī)上算法耗用的時間，因此步長以10-3量級為宜。

權(quán)值的確定需要根據(jù)實際使用過程中每個評價指標(biāo)的重要性排序來綜合確定，是一個客觀與主觀相結(jié)合的靈活變化的量。權(quán)值可以采取普通形式，也可以采取歸一化的形式。為了更方便進(jìn)行對比，同時為其他智能優(yōu)化算法預(yù)留接口，該文采取歸一化的權(quán)值確定方式。同時注意權(quán)值務(wù)必使適應(yīng)度函數(shù)不能是單調(diào)函數(shù)，否則最優(yōu)值必然出現(xiàn)在邊界上，失去了尋優(yōu)的意義。

3.2.3 算法的流程

算法流程如下：1） 隨機(jī)產(chǎn)生初始種群，個體數(shù)目一定，每個個體為染色體的基因編碼。2） 由編碼得到數(shù)值孔徑大小，按照第2.2 節(jié)、第2.3 節(jié)的內(nèi)容計算每個小函量值，采用公式（3）計算適應(yīng)度函數(shù)。3） 每代進(jìn)行最優(yōu)化選擇，使用輪盤賭策略確定個體的適應(yīng)度，并判斷是否符合優(yōu)化準(zhǔn)則，如果符合，就輸出最佳個體及其代表的最優(yōu)解，結(jié)束計算，否則轉(zhuǎn)向第三步。記累計概率為PPi，Pi為個體的選擇概率，如公式（4）所示。共輪轉(zhuǎn)NP次，每次輪轉(zhuǎn)時隨機(jī)產(chǎn)生位于區(qū)間（0，1）內(nèi)的隨機(jī)數(shù)r，當(dāng)PPi-1≤PPi時，選擇個體i。因此，個體的適應(yīng)值越大，其選擇概率越大。4） 根據(jù)適應(yīng)度選擇再生個體，適應(yīng)度高的個體被選中的概率高，適應(yīng)度低的個體可能被淘汰。5） 按照一定的交叉概率和交叉方法生成新的個體。6） 按照一定的變異概率和變異方法生成新的個體。7） 由交叉和變異產(chǎn)生新一代的種群，返回到第二步。

3.3 算法性能分析

選用具體的權(quán)值和步長進(jìn)行算法驗證。硬件平臺為Intel Core i5-5200U（2.20 GHz），4G 內(nèi)存，軟件平臺為Windows 10（64 位）操作系統(tǒng)，Matlab2016Rb 軟件。主要驗證算法的收斂性、時空性和有效性。步長設(shè)定為0.001，權(quán)值分別為0.50、0.10、0.25、0.10 和0.05。采用第3.1 節(jié)、第3.2 節(jié)的內(nèi)容進(jìn)行全局尋優(yōu)，重復(fù)10 次，每次均取得了收斂，自變量的平均值為1.178，平均使用時間為25.234 s。由于分辨率在該算例中的權(quán)值最大，因此在實踐中對數(shù)值孔徑最接近1.178 的顯微成像設(shè)備和其他設(shè)備進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)分辨率在肉眼感知上明顯比其他設(shè)備高。綜上所述，該算法具有較好的收斂性和有效性，空間占用較小，但是算法耗費(fèi)時間略高，需要在下步的研究中進(jìn)行改進(jìn)。

4 結(jié)語

該文按照從理論到實際的思路，從有利方面和不利方面2 個部分分析了高數(shù)值孔徑對STED 超分辨率顯微成像的影響?？傮w來看，高數(shù)值孔徑下STED 超分辨率顯微成像效果更好，但是也會出現(xiàn)很多不利的方面。該文提出了一種新穎的對高數(shù)值孔徑進(jìn)行定量確定的算法，使用遺傳尋優(yōu)的方法達(dá)到全局收斂。在下步的研究工作中，要著重從拓展算法的角度選擇合適的智能算法，根據(jù)不同評價指標(biāo)所占比重的不同，制定完善的目標(biāo)函數(shù)，通過不斷訓(xùn)練達(dá)到收斂的自變量值，自動確定數(shù)值孔徑的最優(yōu)數(shù)值，不斷提高STED 超分辨率顯微鏡數(shù)值孔徑選取的智能化、便捷化水平，并不斷提高算法的時空性能。