侯繼鵬，時曉燕，張業(yè)華，郝貴周，張貴民（魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 273400）

利伐沙班為一種高選擇性抗凝藥物，可直接抑制凝血因子Ⅹa，從而達(dá)到抗凝目的。臨床上用于降低關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防骨科大手術(shù)后深靜脈血栓形成，提高非瓣膜性心房顫動患者抗凝治療的臨床療效[1-5]。

利伐沙班的合成工藝主要使用三個起始物料，其中4-（4-氨基苯基）-3-嗎啉酮為合成利伐沙班的中心前體，與化合物2-[（2S）-2-環(huán)氧乙烷基甲基]-1H-異吲哚-1，3-（2H）-二酮和5-氯噻吩-2-碳酰氯為原料合成利伐沙班[6]。這三個起始物料均含有基因毒性警示結(jié)構(gòu)，具有潛在的基因毒性[7]，它們及其副反應(yīng)產(chǎn)物可能殘留于利伐沙班。目前對于4-（4-氨基苯基）-3-嗎啉酮及其副產(chǎn)物雜質(zhì)、5-氯噻吩-2-碳酰氯及其副產(chǎn)物雜質(zhì)、2-[（2S）-2-環(huán)氧乙烷基甲基]-1H-異吲哚-1，3-（2H）-二酮的研究均已有報(bào)道[8-14]，但未見2-[（2S）-2-環(huán)氧乙烷基甲基]-1H-異吲哚-1，3-（2H）-二酮副產(chǎn)物雜質(zhì)（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮的相關(guān)研究。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）定量測定利伐沙班中的基因毒性雜質(zhì)（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮，根據(jù)人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）M7和2020年版《中國藥典》9306遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則相關(guān)規(guī)定[15-16]，基于毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）法，控制（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮限度為50 μg·g－1，以保證利伐沙班的用藥安全，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish TSQ Altis型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司）；十萬分之一電子天平MS105DU（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

利伐沙班原料藥（山東新時代藥業(yè)有限公司，含量＞98.0%，批號：595190401、595190402、595190403、59171201、59171202、59171203）；（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮對照品（深圳斯坦德，含量：99.2%，批號：1894253R-YX-01）；甲酸（質(zhì)譜級，賽默飛世爾科技公司）；乙腈為（質(zhì)譜級，Merck公司）；水（超純水，美國Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

UPLC系統(tǒng)：色譜柱 Thermo Hypersil Gold C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；以0.1%甲酸為流動相 A，0.1%甲酸乙腈為流動相 B，梯度洗脫（0～10 min，20%～40%B；10～10.1 min，40%～20%B；10.1～15 min，20%B）；流速 0.2 mL·min－1；柱溫 25℃；進(jìn)樣量 20 μL。

質(zhì)譜：離子源為電噴霧電離源（ESI），正離子模式采集；選擇多監(jiān)測模式（MRM），噴霧電壓為3500 V，離子傳輸管溫度為320℃；定量監(jiān)測離子對m/z239.95→186.11，碰撞電壓為16.30 V；定性監(jiān)測離子對m/z239.95→221.97，碰撞電壓為10.01 V。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮對照品適量，加25%乙腈溶解并定量稀釋制成150 ng·mL－1的溶液，作為對照品儲備液；精密量取對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，用25%乙腈稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取利伐沙班約15 mg，置50 mL量瓶中，依次加乙腈12.5 mL、水3 mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.3 專屬性

取空白溶液（25%乙腈）、對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮的保留時間為6.667 min。空白溶液及供試品溶液不干擾雜質(zhì)的測定。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 1 Specific test chromatogram

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對照品儲備液適量，用25%乙腈分別稀釋制成1.50、3.74、7.49、14.98、22.47、29.96 ng·mL－1的對照品溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A＝7.241×104C＋1.778×104，r＝0.9991，表明（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮在1.50～29.96 ng·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 定量限和檢測限

取對照品儲備液，用25%乙腈逐級稀釋至信噪比（S/N）約為10，測定定量限；用25%乙腈逐級稀釋至S/N約為3，測定檢測限。測得（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮的定量限為1.50 ng·mL－1，檢測限為0.45 ng·mL－1。

2.6 回收試驗(yàn)

精密稱定利伐沙班15 mg，置50 mL量瓶中，依次加乙腈12.5 mL、水3 mL使溶解，共9份，各加入對照品儲備液0.5、1、1.5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，制成低、中、高濃度的溶液，每個濃度平行制備3份。依法測定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表1，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Recovery

2.7 精密度、重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，加25%乙腈稀釋至刻度，搖勻，配制6份，進(jìn)樣測定，計(jì)算（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮峰面積的RSD為0.63%（n＝6），表明本方法精密度良好。

精密稱取利伐沙班 15 mg，置50 mL量瓶中，依次加乙腈12.5 mL、水3 mL使溶解，加入對照品儲備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，配制6份，進(jìn)樣測定，結(jié)果（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮含量的RSD為2.8%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新配制的對照品溶液，在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。計(jì)算得（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮峰面積的RSD為4.3%，表明對照品溶液于室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測定

取6批利伐沙班原料藥，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液。精密量取供試品和對照品溶液，分別進(jìn)樣測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算6批利伐沙班中（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮的含量，結(jié)果6批次利伐沙班中均未檢出。

3 討論

基因毒性雜質(zhì)由于其毒性相對較高，引起了國內(nèi)外藥物工作者的高度重視，各藥品管理機(jī)構(gòu)發(fā)布了相應(yīng)的指導(dǎo)原則，對基因毒性雜質(zhì)推薦以TTC 1.5 μg·d－1來控制用藥風(fēng)險(xiǎn)?；赥TC，根據(jù)利伐沙班產(chǎn)品說明書，以使用利伐沙班每日最大口服劑量30 mg·d－1計(jì)算，控制（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮的限度須不超過50 μg·g－1。

方法摸索時，根據(jù)（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮的結(jié)構(gòu)，選擇采用ESI離子源，正離子檢測模式，使用三通連接注射泵、超高效液相色譜儀和質(zhì)譜檢測器，調(diào)整質(zhì)譜的參數(shù)使雜質(zhì)的響應(yīng)達(dá)到最大；同時根據(jù)儀器優(yōu)化的離子對，選擇m/z239.95 → 186.11為定量離子對，m/z239.95 → 221.97為定性離子對，采用同時進(jìn)行定性定量的方法提高檢測方法的準(zhǔn)確度，防止假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

應(yīng)用TTC法計(jì)算得到雜質(zhì)的限度較低，當(dāng)質(zhì)譜常規(guī)進(jìn)樣量為5 μL時發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)的響應(yīng)無法達(dá)到檢測限度要求，故提高進(jìn)樣量至20 μL，使方法滿足限度檢測要求；但此時系統(tǒng)進(jìn)樣體積較大，而UPLC系統(tǒng)的管路及色譜柱較細(xì)，雜質(zhì)產(chǎn)生較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)，峰形較差。根據(jù)流動相中有機(jī)相的比例，測試25%、30%、40%乙腈為稀釋液發(fā)現(xiàn)，使用25%和30%乙腈為稀釋液時（S）-2-（2-羥基-氯丙基）-1H-異吲哚-1，3-二酮峰形較好，使用40%乙腈峰形變差，最終選擇25%乙腈為稀釋液。

利伐沙班在水中溶解性較差，直接使用25%乙腈配制質(zhì)量濃度為0.3 mg·mL－1的利伐沙班時，供試品無法完全溶解；經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)可以先加部分乙腈和水讓利伐沙班原料溶解，然后再加水進(jìn)行定容，用25%乙腈作為稀釋液的配制思路進(jìn)行供試品的配制。通過加標(biāo)驗(yàn)證該配制方法雜質(zhì)回收率較好，解決了原料無法完全溶解的問題。