王夢(mèng)琪，羅定強(qiáng)，劉海靜*（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 71046；. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，西安 710065）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch、三角葉黃連Coptis deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云連Coptis teetaWall.的干燥根莖[1]，收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部中，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效；常用于治療濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，目赤，牙痛等疾病[2]。黃連花薹為毛茛科植物黃連屬黃連的干燥花序，春季開花，其花為淡黃色；黃連的花期較短，一般為每年2～4月，在移栽后第2年春季開花，開花后會(huì)消耗植物大量養(yǎng)分，為了提高藥用部分（根莖）的產(chǎn)量，黃連生產(chǎn)基地除了會(huì)將少數(shù)黃連花薹留種外，其余均摘除丟棄，造成了資源的浪費(fèi)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連花薹具有抗氧化、潤(rùn)腸通便和保護(hù)心肌缺血再灌注損傷等藥理作用[3-5]，具有良好的開發(fā)利用價(jià)值。目前在黃連種植基地已將黃連花薹開發(fā)成花茶保健品供應(yīng)于市場(chǎng)[6-7]，但是黃連花薹的化學(xué)成分還未得到充分研究，與其根莖的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制差別也不明確，同時(shí)又缺乏相關(guān)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)方法，從而造成了黃連植物資源的浪費(fèi)。基于我國(guó)“綠色發(fā)展”及“資源綜合利用”的發(fā)展理念，為了綜合利用黃連中藥材資源[8]，本文以黃連花薹為研究對(duì)象，采用薄層鑒別法（TLC）與高效液相色譜法對(duì)比，尋找出黃連藥材與黃連花薹中含量最大的差異性成分，采用聚酰胺柱層析等分離手段對(duì)黃連花薹與黃連藥材差異性成分進(jìn)行提取分離純化，并采用液質(zhì)聯(lián)用以及核磁鑒定的方法對(duì)差異性成分進(jìn)行確證，同時(shí)建立一測(cè)多評(píng)法（QAMS）[9]測(cè)定黃連花薹中酚酸類（綠原酸）、黃酮類（蒙花苷、蘆?。?、生物堿類（小檗堿）4個(gè)成分的含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為黃連花薹質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AVANCE 3HD 600 MHz 型核磁共振波譜儀（美國(guó)布魯克公司）；LC-2030C 3D高效液相色譜儀（日本島津）；e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters）；質(zhì)譜儀AB 5500＋（美國(guó)AB公司）；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；ME-204電子分析天平（梅特勒-托利多儀器公司）；BP211D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；高純水儀 UPH-Ⅱ-10T（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；數(shù)控超聲儀（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（LABORIA4001，德國(guó)Heidoph公司）。

1.2 試藥

乙醇（工業(yè)乙醇）、乙腈（色譜純）（霍尼韋爾國(guó)際公司），高純水、磷酸（分析純）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），三乙胺（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），聚酰胺（30～60目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：11053-202018，純度：96.1%）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-201610，純度：91.9%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-202015，純度：85.9%）、蒙花苷（批號(hào)：111528-201710，純度：96.6%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

黃連花薹采自陜西省安康市南皋縣、重慶市石柱縣，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥室主任羅定強(qiáng)主任藥師鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisFranch）的干燥花序。

2 黃連花薹特征成分的分離與純化

2.1 提取

取黃連花薹樣品700 g 粉碎，過(guò)二號(hào)篩，以85%乙醇溶液回流提取3次，8倍量溶劑，每次1.5 h，合并濾液，真空減壓干燥，得到總浸膏（191 g），備用。

2.2 聚酰胺柱層析分離與純化[10-14]

用少量的5%乙醇溶液溶解黃連花薹浸膏50.04 g，加入已處理好的聚酰胺，水浴上低溫?fù)]去溶劑，干法上樣，柱規(guī)格為 6.0 cm×100 cm，有效柱長(zhǎng) 88 cm，分別用95%水-乙醇、90%水-乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫過(guò)程每100 mL收集餾分，用TLC跟蹤檢查，合并Rf值相似餾分，減壓濃縮至干，趁熱加入少量20%乙醇溶液使溶解，放置室溫后轉(zhuǎn)入冰箱內(nèi)進(jìn)行低溫析晶，靜置過(guò)夜后得到大量晶體，抽濾后，得到化合物Ⅰ（116.5 mg）。將所得晶體經(jīng) HPLC 法測(cè)定，利用峰面積歸一化法，測(cè)定純度＞95%。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ為淡黃色無(wú)定型粉末，純度為95%；分子式為C28H32O14，ESI-MSm/z：593.1（[M＋H]＋）；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.92（s，1H，5-OH），8.06（d，J＝8.9 Hz，2H，H-2'，6'），7.16（d，J＝8.9 Hz，2H，H-3'，5'），6.96（s，1H，H-3），6.80（d，J＝2.5 Hz，1H，H-8），6.46（d，J＝2.5 Hz，H-6），5.45（m，1H，-OH），5.24（d，J＝5.0 Hz，1H，-OH），5.21（m，1H，-OH），5.07（d，J＝7.4 Hz，1H，H-1''），4.71（m，1H，-OH），4.62（m，1H，-OH），4.56（s，1H，H-1'''），4.47（m，1H，-OH），3.87（s，3H，4'-OCH3），3.86（s，1H，H-6''），3.68（m，1H，H-2'''），3.62（m，1H，H-5'''），3.45（m，1H，H-3''），3.45（m，1H，H-6''），3.42（m，1H，H-5'''），3.33（m，1H，H-3''），3.29（m，1H，H-2''），3.17（m，1H，H-4''），3.15（m，1H，H-4'''），1.09（d，J＝6.3 Hz，3H，H-6'''）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：18.30（C-6'''），56.06（4'-OCH3），66.57（C-6''），68.81（C-5'''），70.07（C-4''），70.83（C-3'''），71.22（C-2'''），72.53（C-4'''），73.55（C-2''），76.14（C-5''），76.73（C-3''），95.26（C-8），100.13（C-1''），100.40（C-1'''），101.01（C-6），104.30（C-3），105.94（C-10），115.20（C-3'，5'），123.16（C-1'），128.95（C-2'，6'），157.46（C-7），161.63（C-5），162.92（C-4'），163.44（C-9），164.43（C-2），182.53（C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與已知化合物Ⅰ的譜圖數(shù)據(jù)[15]一致，確認(rèn)為蒙花苷（linarin），結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物Ⅰ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of compound Ⅰ

圖2 混合對(duì)照品（A）和黃連花薹樣品（B）的HPLC圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and Coptis chinensis flower moss sample（B）

3 QAMS法同時(shí)測(cè)定黃連花薹特征成分及其他3個(gè)成分的含量

3.1 對(duì)照品溶液的制備[16-20]

精密稱取綠原酸對(duì)照品5.92 mg置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.2368 mg·mL－1儲(chǔ)備液；精密稱取蘆丁對(duì)照品6.18 mg置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.1236 mg·mL－1儲(chǔ)備液；精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品7.16 mg置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.2864 mg·mL－1儲(chǔ)備液；精密稱取蒙花苷對(duì)照品3.46 mg，置25 mL量瓶中，分別加入綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿儲(chǔ)備液2 mL、3 mL、5 mL，配制成含綠原酸0.018 21 mg·mL－1、蘆丁0.013 63 mg·mL－1、鹽酸小檗堿0.049 20 mg·mL－1、蒙花苷0.1337 mg·mL－1對(duì)照品混合溶液（注：儲(chǔ)備液配制濃度為原始濃度，混合對(duì)照品溶液配制濃度均已進(jìn)行折算）。

3.2 供試品溶液的配制

取6批黃連花薹樣品各 0.2 g，分別加入70%乙醇25 mL，稱量，超聲處理（500 W，40 kHz）45 min，取出，放冷，再稱量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.3 色譜條件

采用資生堂C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（每1000 mL加20 μL三乙胺）（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～27 min，92%B；27～45 min，92%→80%B；45～50 min，80%→77%B，50～65 min，77%B→73%B，65～70 min，73%→20%B，70～72 min，20%→92%B，72～75 min，92%B），流速 1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，柱溫 40℃，進(jìn)樣量 10 μL。

3.4 方法學(xué)考察[21-24]

3.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在“3.3”項(xiàng)色譜條件下，4個(gè)待測(cè)成分的理論塔板數(shù)均大于5000，且色譜峰峰形良好，與相鄰峰的分離度大于 1.5?；旌蠈?duì)照品及黃連花薹樣品色譜圖見圖 2。

3.4.2 線性關(guān)系考察 取“3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，稀釋成系列濃度混合對(duì)照品溶液（綠原酸：0.018 21、0.036 42、0.091 05、0.1821、0.2732 μg；蘆丁：0.013 63、0.027 26、0.068 15、0.1363、0.2044 μg；鹽酸小檗堿：0.049 20、0.098 40、0.2460、0.4920、0.7380 μg；蒙花苷：0.1337、0.2674、0.6685、1.3370、2.0055 μg），每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，以對(duì)照品質(zhì)量X和平均峰面積Y進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察Tab 1 Linearity

3.4.3 相對(duì)校正因子計(jì)算 取“3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 1、2、5、10、15 μL進(jìn)樣測(cè)定，按公式[相對(duì)校正因子（fsi）＝（As×Wi）/（Ai×Ws）]（As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，Ai為其他待測(cè)組分的峰面積；Ws為其他待測(cè)組分的質(zhì)量濃度）計(jì)算鹽酸小檗堿對(duì)綠原酸、蘆丁、蒙花苷的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

表2 黃連花薹中4個(gè)成分的相對(duì)校正因子結(jié)果Tab 2 Relative correction factors of 4 components in Coptis chinensis flower moss

3.4.4 精密度試驗(yàn) 取“3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿、蒙花苷峰面積RSD分別為 0.99%、1.1%、0.09%、0.43%，表明儀器精密度良好。

3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黃連花薹供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25、30、35、40 h進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，計(jì)算得到40 h內(nèi)綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿、蒙花苷色譜峰峰面積的RSD分別為1.9%、0.97%、1.2%和1.1%，表明供試品溶液在40 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批黃連花薹樣品，每份 0.2 g，共 6 份，精密稱定，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，得到6份樣品綠原酸、蘆丁、鹽酸小檗堿、蒙花苷的平均含量分別為2.2486、1.9353、6.1675、21.5566 mg·g－1，RSD分別為0.59%、0.31%、0.32%、0.28%，表明此方法重復(fù)性良好。

3.4.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的黃連花薹樣品適量，每份約 0.1 g，共 9 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入相當(dāng)于含有量80%、100%、120%的混合對(duì)照品溶液，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果4種成分的平均加樣回收率在 94.88%～96.68%，RSD均小于3.0%，表明該方法的準(zhǔn)確性較好。

3.4.8 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 取6批黃連花薹樣品各2份，分別按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用QAMS法和外標(biāo)法（ESM）計(jì)算各成分含量。結(jié)果表明，QAMS法與ESM法測(cè)得綠原酸、蘆丁、蒙花苷含量基本一致，驗(yàn)證了采用QAMS法測(cè)定黃連花薹中含量具有可行性，見表3。

表3 QAMS與外標(biāo)法ESM測(cè)得黃連花薹中4個(gè)成分的含量比較結(jié)果(mg·g－1，n＝3)Tab 3 Content of 4 components in Coptis chinensis flower moss measured by QAMS and ESM (mg·g－1，n＝3)

3.4.9 校正因子耐用性考察

① 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響：分別考察 Waters 2495、島津LC-2030C 3D、安捷倫1260 型 3種高效液相色譜儀及Agilent TCC18、Kromasil 100-5C18、資生堂C183 種色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果RSD均＜3.0%，表明不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)明顯影響，結(jié)果見表4。

表4 不同條件對(duì)相對(duì)校正因子的考察結(jié)果Tab 4 Relative correction factors under different conditions

② 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響：采用Waters e2695高效液相色譜儀和資生堂C18，分別考察流速為0.8、1.0、1.2 mL·min－1對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果RSD均＜3.0%，表明不同流速對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)明顯影響，結(jié)果見表4。

③ 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響：采用Waters e2695高效液相色譜儀和資生堂C18色譜柱，分別考察不同柱溫30、35、40℃時(shí)的相對(duì)校正因子。結(jié)果表明不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子無(wú)明顯影響，結(jié)果見表4。

4 討論

4.1 黃連花薹特征成分的選擇

通過(guò)兩種不同的TLC系統(tǒng)：① 固定相為聚酰胺薄膜，展開劑為50%乙醇；② 固定相為硅膠G，展開劑為乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1），顯色劑為1%三氯化鋁乙醇試液，加熱，置365 nm下觀察，發(fā)現(xiàn)了與黃連藥材明顯不同的清晰斑點(diǎn)；又通過(guò)HPLC法，對(duì)比找出與黃連藥材不同的色譜峰，其峰面積占黃連花薹峰面積的22.62%，故將其作為黃連花薹與黃連藥材的差異性成分。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察提取時(shí)間（1 h、1.5 h、2 h），乙醇濃度（70%、85%、95%），溶劑用量（6倍、8倍、10倍）三因素三水平對(duì)黃連花薹差異性成分提取率的影響，結(jié)果顯示，在70%乙醇濃度，加入8倍量溶劑，提取1.5 h，得到黃連花薹差異性成分的出膏率最高。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)各成分在紫外吸收譜圖來(lái)確定檢測(cè)波長(zhǎng)。綠原酸在326 nm處有最大吸收，蘆丁在354 nm處有最大吸收，鹽酸小檗堿在344 nm處有最大吸收，蒙花苷在332 nm處有最大吸收，混合對(duì)照品在340 nm處響應(yīng)值較好，故最終選擇340 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.3 內(nèi)參物的選擇

鹽酸小檗堿是2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的黃連質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，而且其在供試品溶液中含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定，較易獲得，故選擇為內(nèi)參物。

4.4 供試品溶液制備方式的考察

本研究考察了提取溶劑、提取方式、提取體積、提取時(shí)間對(duì)黃連花薹特征成分提取效果的影響，結(jié)果顯示超聲提取法對(duì)特征成分的提取率較高，考慮到超聲法操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間，以及酚酸類化合物的不穩(wěn)定性（待測(cè)成分中有綠原酸），最終選擇70%乙醇超聲提取45 min作為提取條件。

4.5 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了采用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1% 磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）溶液作為流動(dòng)相對(duì) 4個(gè)待測(cè)成分含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示用乙腈-0.1% 磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）時(shí)的峰形效果較好，故選擇溶液乙腈-0.1%磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）為流動(dòng)相?？疾觳煌荻认疵摮绦?，在最終確定的色譜條件下，4個(gè)待測(cè)成分峰形良好，理論塔板數(shù)均大于5000，待測(cè)成分間以及與樣品中其他成分之間的分離度良好。

4.6 指標(biāo)的選擇

2020年版《中國(guó)藥典》中以鹽酸小檗堿的含量來(lái)控制黃連藥材的質(zhì)量，規(guī)定以鹽酸小檗堿計(jì)，含小檗堿不得少于5.5%，測(cè)定的黃連花薹樣品中鹽酸小檗堿含量在0.626%～0.679%，僅用鹽酸小檗堿作為黃連花薹的質(zhì)量控制指標(biāo)專屬性較差，同時(shí)蒙花苷為黃連花薹與黃連藥材的差異性成分，在測(cè)定4個(gè)化學(xué)成分中含量最高，并且與黃連藥材相比具有專屬性。蒙花苷具有較好抗炎、抗氧化活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)肝、腎等器官有保護(hù)作用，可調(diào)節(jié)骨代謝，還具有降血壓、抑制膽堿酯酶活性等藥理作用，說(shuō)明黃連花薹極具開發(fā)利用價(jià)值[25]。由于蘆丁、綠原酸在黃連花薹中成分含量較高且易于測(cè)定，因此本文選擇用蘆丁、綠原酸、鹽酸小檗堿、蒙花苷作為黃連花薹測(cè)定的指標(biāo)性成分。

5 小結(jié)

迄今為止，黃連藥材的化學(xué)成分、藥理作用等已有相關(guān)的研究，但是對(duì)于黃連花薹的化學(xué)成分、藥理活性等方面的研究涉及甚少，且其具有降脂、降糖、抗氧化的作用，與黃連藥材的治療功效有所不同。于是，本研究選擇黃連花薹作為研究對(duì)象，尋找并分離了黃連藥材與黃連花薹中不同的化學(xué)成分，建立了QAMS同時(shí)測(cè)定黃連花薹差異性成分及其他3個(gè)成分的含量，可用于黃連花薹的質(zhì)量控制，為開發(fā)黃連花薹提供參考。