曾女金，邢孟韜，何玲（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是一種常見的腦腫瘤，惡性程度高，被世界衛(wèi)生組織歸類為Ⅳ級膠質(zhì)瘤，年發(fā)病率約4.03/10萬[1]。目前針對膠質(zhì)瘤的治療以最大程度手術(shù)切除為主，輔以放化療。但綜合治療后，大多數(shù)患者仍在相對較短的時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)腫瘤往往更具侵襲性和耐藥性，導(dǎo)致患者預(yù)后不良，中位生存期少于兩年[2]。減少GBM復(fù)發(fā)是亟待解決的臨床問題。

DNA損傷性化療藥物和輻照可能引起腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的衰老，這種現(xiàn)象被稱為治療誘導(dǎo)性衰老（therapy-induced senescence，TIS）[3]。GBM具有高侵襲性，雖然目前對GBM的最大安全性切除通常包括腫瘤以外的區(qū)域，但切除邊緣仍可能存在殘留GBM細(xì)胞[4]。浸潤到正常組織中的腫瘤細(xì)胞在放化療作用下被誘導(dǎo)衰老，生長增殖受到抑制，使患者受益。但越來越多的臨床及臨床前研究證據(jù)表明，放化療會引起腫瘤和正常組織中衰老細(xì)胞累積，持續(xù)增加的衰老細(xì)胞可能分泌多種促腫瘤因子，誘導(dǎo)GBM復(fù)發(fā)[5-6]；且殘留GBM細(xì)胞在治療壓力誘導(dǎo)的衰老狀態(tài)下可能轉(zhuǎn)化為對治療有更高抗性的分子亞型，產(chǎn)生惡性更強(qiáng)的復(fù)發(fā)腫瘤[7-8]，引起患者不良預(yù)后，表現(xiàn)出比初發(fā)時(shí)更高的轉(zhuǎn)移率和病死率?；谒ダ霞?xì)胞在腫瘤治療中的雙重作用，完善TIS有關(guān)治療策略成為眾多科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。本文就TIS對GBM治療的影響作一綜述，旨在為降低GBM復(fù)發(fā)和研發(fā)GBM治療藥物提供參考。

1 放化療引起GBM細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老（cellular senescence）是發(fā)生在二倍體細(xì)胞中的一種穩(wěn)定的細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象，最早于19世紀(jì)60年代由Hayflick和Moorhead提出[9]。體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)50～70代后即喪失增殖能力并進(jìn)入生長停滯狀態(tài)，達(dá)到“Hayflick極限”，這種衰老類型被命名為復(fù)制型衰老（replicative senescence）。除復(fù)制型衰老外，在各種壓力刺激下，細(xì)胞也會發(fā)生衰老，這種衰老沒有明顯端粒缺失，被命名為早衰，TIS就是早衰的一種[3]。

放化療引起GBM細(xì)胞廣泛發(fā)生衰老。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是治療GBM的一線化療藥物，通過誘導(dǎo)O6-甲基鳥嘌呤（O6-methylguanine，O6MeG）發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞死亡。關(guān)于替莫唑胺的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，除誘導(dǎo)凋亡和自噬外，替莫唑胺還可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞大量發(fā)生衰老[10]。近期的一項(xiàng)研究指出，使用替莫唑胺處理GBM細(xì)胞后，衰老細(xì)胞逐漸增多，第8日時(shí)達(dá)到80%，是凋亡細(xì)胞數(shù)量的4倍，這表明衰老可能是TMZ治療后的主要反應(yīng)[4]。同樣，輻照放療也會誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[11-12]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)輻照導(dǎo)致60%～80%的GBM細(xì)胞生長停滯，進(jìn)入衰老狀態(tài)，白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1α、IL-1β等衰老相關(guān)因子表達(dá)增加，NF-κB途徑被激活。

通常而言，TIS以一種細(xì)胞自主調(diào)控的方式限制DNA損傷細(xì)胞的增殖，從而阻止腫瘤發(fā)展。因此，以各種治療手段加速腫瘤細(xì)胞的衰老成為既往腫瘤治療的一大理論基石。各種臨床常見的化療藥物，如烷化劑、鉑類等藥物，都是常見的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)劑；部分分子靶向藥物也可導(dǎo)致細(xì)胞衰老，達(dá)到治療腫瘤的目的[13]。然而，隨著腫瘤研究的深入，TIS帶來的潛在問題逐漸暴露。腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療或放射治療后進(jìn)入衰老狀態(tài)，衰老腫瘤細(xì)胞通過退出細(xì)胞周期來躲避化療藥物的直接細(xì)胞毒性作用，可能在治療結(jié)束后幸存，進(jìn)入蟄伏狀態(tài)，伺機(jī)而動，引起腫瘤復(fù)發(fā)。

2 治療壓力誘導(dǎo)衰老細(xì)胞重編程

衰老在過去一直被認(rèn)為是一種不可逆轉(zhuǎn)的生長停滯狀態(tài)，但最近的研究表明，一些已表現(xiàn)出衰老的腫瘤細(xì)胞亞群可能逃逸衰老，恢復(fù)增殖能力，且恢復(fù)的細(xì)胞可能比親本細(xì)胞群更具侵襲性[14]。基于大規(guī)模的表觀遺傳重編程和增強(qiáng)的可塑性，衰老的腫瘤細(xì)胞可能在治療壓力下進(jìn)化，獲得更惡性的表型特征，出現(xiàn)治療抗性，進(jìn)而引起腫瘤復(fù)發(fā)。替莫唑胺誘導(dǎo)的DNA損傷是引起GBM細(xì)胞發(fā)生衰老的主要觸發(fā)因素，該過程由MRN-ATR-CHK1途徑的激活引發(fā)，并依賴于CDC25c降解[15]，此外該過程還伴隨著E2F1/DP1復(fù)合物的破壞，導(dǎo)致DNA修復(fù)因子EXO1、MSH2、MSH6和RAD51的下調(diào)，進(jìn)而引起DNA錯配修復(fù)和同源重組下調(diào)。DNA損傷修復(fù)能力下降，積累遺傳改變，可能阻礙衰老的誘導(dǎo)和維持，包括CDKN2A純合子丟失，或TP53相關(guān)途徑突變[14]。

還有研究揭示，TIS可能通過促進(jìn)細(xì)胞重編程誘導(dǎo)干性表型來推動腫瘤生長[16-17]。衰老的關(guān)鍵組件，如p16INK4a、p21CIP1、p53以及組蛋白H39號位賴氨酸處的三甲基化（H3K9me3）等，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞干性的關(guān)鍵因子，表明細(xì)胞衰老和細(xì)胞干性由重疊的信號網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)[16]。衰老相關(guān)的干細(xì)胞是一種意料之外的細(xì)胞自主特征，在逃離細(xì)胞周期阻滯后表現(xiàn)出高侵襲性的生長潛力，并在復(fù)發(fā)腫瘤中富集。根據(jù)基因特征，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（glioblastoma stem cells，GSCs）可分為前神經(jīng)型（proneural GSCs，pGSCs）和間質(zhì)型（mesenchymal GSCs，mGSCs）[18]。在腫瘤治療中，原發(fā)性GBM會傾向于發(fā)生原神經(jīng)-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（proneural-mesenchymal transition，PMT）[19]，pGSCs在放化療期間，原神經(jīng)樣相關(guān)特征（如CD133、OLIG2）減少，間充質(zhì)樣基因特征（如CD44、YKL40）上調(diào)，轉(zhuǎn)化為mGSCs，且復(fù)發(fā)GBM中mGSCs顯著增加。PMT過程是GBM復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[20]，包含多個信號通路的激活，涉及NF-κB、Notch1、C/EBP-β等關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。有趣的是，這些信號通路也在TIS中被激活[21]，提示GSCs的PMT過程與衰老相關(guān)基因表達(dá)特征具有相似性。衰老細(xì)胞重編程可能促進(jìn)GSCs發(fā)生干細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)化，侵襲性增強(qiáng)，惡性程度變高，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和患者不良預(yù)后。

3 治療誘導(dǎo)腦內(nèi)衰老細(xì)胞積累

除了對腫瘤細(xì)胞的影響外，放化療手段也可能引起腦中非腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老[6]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中最豐富的細(xì)胞類型，研究發(fā)現(xiàn)，放療會引起小鼠大腦中廣泛的細(xì)胞衰老[22-24]，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老，且輻照后衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)了小鼠膠質(zhì)瘤的生長，侵襲性增強(qiáng)。衰老基質(zhì)細(xì)胞通過分泌多種促腫瘤因子，促進(jìn)鄰近腫瘤細(xì)胞的生長，包括生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分等。比如衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞過量分泌肝細(xì)胞生長因子（HGF），激活間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體外的遷移和侵襲；衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞也會產(chǎn)生過量的纖連蛋白，促進(jìn)細(xì)胞存活和侵襲[22]。衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8，可以激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的NF-κB和STAT3信號傳導(dǎo)，以維持其干性并促進(jìn)其侵襲性。此外，研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)衰老后，其培養(yǎng)基中c-Myc水平升高，當(dāng)與GBM細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，增加的c-Myc可以促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖，并提高后者對替莫唑胺的耐藥性[25]?？傊ダ匣|(zhì)細(xì)胞可能通過旁分泌作用促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)，且導(dǎo)致復(fù)發(fā)腫瘤的治療抗性。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤常發(fā)生于年齡較大的人，其中確診為異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）野生型腫瘤的患者中位年齡是62歲[5，26]。確診時(shí)的年齡與生存率成負(fù)相關(guān)，這種不良預(yù)后主要?dú)w因于腫瘤切除程度以及與高齡相關(guān)的體質(zhì)虛弱或恢復(fù)不佳，但有學(xué)者指出這可能在一定程度上也與大腦老化有關(guān)[5]。腦中增多的衰老細(xì)胞既是人衰老的原因，也促進(jìn)了癌癥的發(fā)展，且年齡相關(guān)性炎癥已在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中被證明[27]。矛盾的是，放射治療和各種抗癌化療藥物引起腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的衰老，造成組織內(nèi)衰老細(xì)胞大量增加；且TIS會降低免疫系統(tǒng)對衰老腫瘤細(xì)胞的去除效率，進(jìn)一步導(dǎo)致衰老細(xì)胞在腫瘤和治療小鼠的正常組織中積累[3]。這意味著當(dāng)對GBM患者采用放化療手段治療時(shí)，本身就可能會誘導(dǎo)其腦部衰老細(xì)胞的增加，這可能導(dǎo)致進(jìn)一步的不良預(yù)后，包括復(fù)發(fā)。

4 衰老相關(guān)分泌表型的雙重作用

衰老細(xì)胞具有增強(qiáng)的分泌活性，產(chǎn)生衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），包括炎癥介質(zhì)、生長因子、MMPs等[3，27]。在治療早期，通過SASP，衰老細(xì)胞可以旁分泌誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞衰老，起到阻止腫瘤生長的屏障作用。且SASP由多種趨化因子和細(xì)胞因子組成，可激活免疫監(jiān)視，并帶來先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，清除衰老和增殖的腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)衰老對腫瘤的抑制能力。

但隨著衰老細(xì)胞的增多以及衰老進(jìn)程的加速，持續(xù)激活的SASP信號可能反過來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。SASP中有多種炎性因子，過量釋放的炎性因子可能引起局部和全身的炎癥，促進(jìn)多種疾病發(fā)展（包括腫瘤），引起患者不良預(yù)后[28-29]。SASP中的多種因子有促腫瘤的特性，如MMP3可以促進(jìn)腫瘤侵襲；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促進(jìn)腫瘤血管生成。SASP的持續(xù)激活還能重塑腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，引起GBM復(fù)發(fā)[30]。在異種移植小鼠模型中，與僅注射未照射的對照細(xì)胞相比，聯(lián)合注射經(jīng)照射的、衰老的原代GBM細(xì)胞和未照射的GBM將產(chǎn)生更大的、侵襲性更強(qiáng)的腫瘤塊[31]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)衰老細(xì)胞出現(xiàn)在疾病后期時(shí)，SASP會抑制免疫監(jiān)視，幫助衰老逃逸，從而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。

5 GBM治療的新方向

衰老和SASP在腫瘤治療中是一把雙刃劍，如何更好地發(fā)揮TIS在腫瘤治療中的抑癌作用而避免其促癌作用，是目前完善腫瘤治療方案的關(guān)鍵。衰老細(xì)胞的持續(xù)存在和SASP的負(fù)面作用是主要問題，因此多項(xiàng)研究開始聚焦于選擇性清除衰老細(xì)胞或減少衰老細(xì)胞的產(chǎn)生，衰老消融劑（senolytics），是一類選擇性清除衰老細(xì)胞的藥物[32-33]，包括靶向性小分子化合物和天然化合物。

5.1 BCL-2蛋白家族抑制劑

細(xì)胞在治療壓力下發(fā)生衰老，相較于發(fā)生凋亡這種直接的細(xì)胞死亡，是一種更溫和的細(xì)胞反應(yīng)。此時(shí)細(xì)胞雖周期停滯，但仍保持較高的代謝水平和細(xì)胞活力[14]。實(shí)際上，凋亡抗性是衰老細(xì)胞的特征之一，可能有助于它們在衰老組織和化療后積聚。NF-κB在衰老細(xì)胞中被激活，誘導(dǎo)抗凋亡因子產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，保持細(xì)胞活力和代謝。BCL-2蛋白家族，包括Bcl2、BclW、Bcl-XL和Mcl-1，在細(xì)胞死亡相關(guān)過程（包括自噬和凋亡）中起核心作用，在衰老細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[34]；因此，針對這些蛋白的化合物作為衰老消融劑被廣泛研究。研究顯示，BCL-2家族抑制劑顯示出緩解年齡相關(guān)疾病（如腫瘤）的潛力[33]。ABT-737是最早發(fā)現(xiàn)的BclW/Bcl-XL抑制劑之一，它能在體內(nèi)和體外優(yōu)先誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的凋亡[35]。然而，ABT-737的口服利用度較低，于是一種可口服類似物ABT-263（Navitoclax）被開發(fā)出來，并作為第一代Bcl2/Bcl-XL抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)[36]。無論是替莫唑胺還是輻照誘導(dǎo)的衰老GBM細(xì)胞系，都可以被ABT-263選擇性地清除[14]。實(shí)驗(yàn)揭示，當(dāng)對C57BL6/J小鼠輻照一段時(shí)間后再移植腫瘤，與對照組相比，預(yù)先使用ABT-263消除衰老細(xì)胞的小鼠腫瘤生長更慢，存活期更長[22]。

5.2 p53再激活

p53是一種常見的腫瘤抑制蛋白，激活的p53會誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1、G2和S期，以便基因組DNA在合成受損時(shí)有時(shí)間修復(fù)自己，從而防止異常細(xì)胞增殖和保護(hù)癌基因應(yīng)激的基因組完整性[37]。恢復(fù)細(xì)胞核內(nèi)p53的水平被認(rèn)為是治療多種癌癥的潛在方法，包括GBM[38]。小鼠雙微體擴(kuò)增基因2（mouse double minute 2，MDM2）誘導(dǎo)p53降解，其抑制劑可以有效恢復(fù)p53水平，盡管這種作用僅在具有MDM2擴(kuò)增和突變型TP53的GBM（8%～10%）中有效[38]。FOXO4（Forkhead box protein O4）可以螯合p53以促進(jìn)周期停滯并阻止其引發(fā)細(xì)胞凋亡[39]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用細(xì)胞穿透性阻斷肽可以從FOXO4中解離p53，使之重定位到線粒體，繼而引起半胱天冬酶依賴性凋亡[40]。但FOXO4-p53干擾是否能在GBM中起作用仍有待驗(yàn)證。

5.3 HSP90抑制劑

熱休克蛋白90（heat shock protein，HSP90）是一種常見的分子伴侶，已被證明在包括GBM在內(nèi)的多種癌癥中發(fā)揮著促腫瘤的作用[41]。2017年，HSP90抑制劑首次被發(fā)現(xiàn)能作為一種衰老消融劑殺傷衰老癌細(xì)胞[42]，其機(jī)制是抑制HSP90對客戶蛋白的穩(wěn)定作用，從而抑制客戶蛋白的促衰老癌細(xì)胞存活信號。HSP90抑制劑作為抗GBM藥物已被廣泛研究，但這主要是基于其在抑制GBM細(xì)胞活力和增殖方面的作用，其在GBM中清除衰老細(xì)胞的作用目前還沒有報(bào)道。根據(jù)現(xiàn)有證據(jù)，我們有理由認(rèn)為HSP90抑制劑可以作為替莫唑胺的輔助藥物，改善臨床治療效果。

5.4 活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除劑

ROS水平升高對于誘導(dǎo)和維持細(xì)胞衰老狀態(tài)具有潛在的關(guān)鍵作用[43]。放化療通常引起腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞DNA損傷，導(dǎo)致ROS等自由基水平增加，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致衰老發(fā)生。高水平的ROS可直接作用于DNA，觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)及激活NF-κB、MAPK等通路，引起衰老。ROS還可能促進(jìn)腫瘤的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和干性的獲得，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[44]。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞相比，使用替莫唑胺誘導(dǎo)衰老后的細(xì)胞中ROS水平顯著上調(diào)[4]。清除ROS、NO等自由基，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是減少衰老細(xì)胞產(chǎn)生，改善GBM治療效果的有效手段。

5.5 天然化合物

幾種植物來源的天然化合物也展示出有效清除衰老細(xì)胞的作用，且這些化合物具有低毒性的優(yōu)勢，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化為臨床藥物的巨大潛力[32]。達(dá)沙替尼是已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療白血病的藥物，是一種酪氨酸激酶抑制劑，它可以通過選擇性抑制Src激酶促進(jìn)腎上腺素受體依賴的細(xì)胞凋亡[32，45]。當(dāng)達(dá)沙替尼和槲皮素（一種天然類黃酮）聯(lián)合使用時(shí)，可以有效殺死衰老細(xì)胞，緩解小鼠早衰癥狀，改善年齡相關(guān)疾病，如阿爾茨海默病[32，45]。非瑟?。╢isetin）是一種存在于多種蔬菜和水果的天然類黃酮，新的一項(xiàng)研究揭示非瑟汀可以有效降低替莫唑胺誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞數(shù)量。同樣作用的還有青蒿琥酯，一種青蒿素的半合成衍生物。姜黃素作為衰老清除劑的相關(guān)研究也有很多，其已被證明在腦相關(guān)疾病和癌癥中發(fā)揮有益作用。白藜蘆醇也被證明可通過加強(qiáng)替莫唑胺誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞衰老來起作用[14]。此外，白藜蘆醇和其他多酚能夠抑制ROS的形成并限制神經(jīng)元中的細(xì)胞衰老[45]，從而減少衰老基質(zhì)細(xì)胞對GBM的促進(jìn)作用。

抗衰老治療的相關(guān)靶點(diǎn)總結(jié)見表1。

表1 抗衰老治療在GBM中的潛在靶點(diǎn)Tab 1 Potential targets for anti-senescence therapies against GBM

6 結(jié)語

隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展認(rèn)識的逐步加深，細(xì)胞衰老在腫瘤治療中的負(fù)面影響逐漸引起研究者的重視，尤其是持續(xù)存在的衰老細(xì)胞。GBM具有高度可塑性，在治療壓力下可能發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，逃逸衰老后引起更惡性的復(fù)發(fā)腫瘤；且TIS引起腫瘤和非腫瘤細(xì)胞的分泌表型改變，可能建造促腫瘤生長的微環(huán)境，誘導(dǎo)殘留病灶復(fù)發(fā)，給GBM的治愈造成極大的困難。目前，抗衰老治療在GBM中存在較多空白，相關(guān)藥物是否安全有效有待進(jìn)一步研究。了解不同類型的衰老及其在殘留病灶中的作用，以開發(fā)抗衰老療法來對抗化療和放射治療引起的耐藥性，是未來治療GBM，提高患者生存率有希望的途徑。