唐千，王曉麗，邢紅，石玉夢，王濤，陳曉鵬（天津中醫(yī)藥大學(xué) 組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

腎炎康復(fù)片由人參、西洋參、地黃、鹽杜仲、山藥、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹參、澤瀉、白茅根、桔梗13味中藥組成，收載于2020年版《中國藥典》中，具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、清解余毒的功效，臨床上用于氣陰兩虛、脾腎不足、水濕內(nèi)停所致的腰膝酸軟、頭暈?zāi)垦！⒏∧[等癥狀[1]，也廣泛用于慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病等疾病[2-3]。并在2007年被國家食品藥品監(jiān)督管理局列為國家二級中藥保護(hù)品種[4]。目前，關(guān)于腎炎康復(fù)片的研究主要集中于臨床療效研究，體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)鮮有報(bào)道，質(zhì)量控制研究有待深入。

本課題組前期采用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)，利用其高精度、高靈敏度、高分辨率等特點(diǎn)，對腎炎康復(fù)片進(jìn)行成分鑒定分析，共鑒定出78個(gè)化學(xué)成分[5]。在此基礎(chǔ)上，本文對小鼠口服給藥腎炎康復(fù)片后的入血成分進(jìn)行分析，初步闡明其體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；并進(jìn)一步建立多指標(biāo)成分HPLC含量測定方法，以更好地控制其整體質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

LCMS-9030四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Shim-pask GIST C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）（日本島津公司）；1260型高效液相色譜儀、Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美國Agilent公司）；MSA125P-0CE-DU十萬分之一電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；5424 R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；LP Vortex Mixer渦旋混合儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Milli-Q IQ 7005超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

15批腎炎康復(fù)片（批號：17395、17396、17397、17398、17399、17400、17401、17402、17403、17404、17405、17406、17407、17408、17409，天津同仁堂有限公司，規(guī)格：0.48 g/片）。京尼平苷酸（批號：DST190221-040，純度：98%）、京尼平苷（批號：DST180103-032，純度：98%）、水蘇堿（批號：DST180321，純度：98%）、益母草堿（批號：DST180301，純度：98%）、大豆苷（批號：DST180519-019，純度：98%）、丹酚酸B（批號；DST181127-009，純度：98%）、丹參酮ⅡA（批號：DSTDD001101，純度：98%）、落新婦苷（批號：DSTDL005401，純度：98%）（成都德斯特生物科技有限公司）；隱丹參酮（批號：wkq20021006，純度：98%，四川省維克奇生物科技有限公司）。色譜純乙腈和甲醇（美國Fisher公司），水由超純水系統(tǒng)制備。

1.3 動(dòng)物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠17只[北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0008]，體質(zhì)量20～30 g，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院D樓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)條件喂養(yǎng)，溫度22℃，濕度30%～40%，光照12 h交替循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物使用與護(hù)理委員會頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理與使用》。

2 方法與結(jié)果

2.1 腎炎康復(fù)片入血成分鑒定

2.1.1 灌胃藥液的配制 取腎炎康復(fù)片50片，研細(xì)，稱取5 g，加0.5%羧甲基纖維素鈉制備200 mg·mL－1的混懸液，即得腎炎康復(fù)片的灌胃藥液。

2.1.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取京尼平苷酸、水蘇堿、益母草堿、丹參酮ⅡA、京尼平苷對照品適量，加甲醇制成含各對照品約1 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.1.3 血清樣品的采集與制備

① 含藥血清樣品采集：取同批次雄性C57BL/6J小鼠12只，禁食不禁水12 h，灌胃給予腎炎康復(fù)片，藥液給藥劑量：8 g·kg－1，給藥30 min后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，自小鼠腹主動(dòng)脈取血，置于含抗凝劑的離心管中。全血離心，取上清液，即得血清樣品，置－80℃冰箱，待測。

② 空白血清樣品采集：取同批次雄性C57BL/6J小鼠5只，禁食不禁水12 h，給予與腎炎康復(fù)片藥液同等體積的生理鹽水灌胃，其余處理方法同含藥血清樣品采集。

③ 血清樣品的制備：血清樣品于冰上解凍，取200 μL置于1.5 mL離心管中，渦旋振蕩1 min；加入800 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混合 60 s，14 000 r·min－1、4℃離心15 min，取上清液；氮?dú)獯蹈?，?0 μL甲醇溶液復(fù)溶，離心，取上清液，進(jìn)樣分析。

2.1.4 色譜、質(zhì)譜條件

① 色譜條件：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為乙腈；柱溫35℃；流速0.2 mL·min－1；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫（0～10 min，95%～85%A；10～13 min，85%～76%A；13～17 min，76%～70%A；17～19 min，70%～42%A；19～26 min，42%～32%A；26～28 min，32%～8%A；28～30 min，8%～5%A；30～31 min，5%～95%A；31～36 min，95%A）。

② 質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源；數(shù)據(jù)采集模式為正負(fù)離子全掃描、數(shù)據(jù)依賴采集模式；離子源接口電壓－3.0 kV；干燥氣流速10 L·min－1；霧化氣流速3.0 L·min－1；脫溶劑管溫度250℃；加熱塊溫度400℃；接口溫度300℃；掃描模式母離子MS Scan（m/z100～500；500～1000；1000～1500），碎片離子MS/MS（m/z50～500；50～1000；50～1500）；碰撞能量為 18～52 V。校準(zhǔn)方法為外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)（調(diào)諧液為 NaI，質(zhì)量濃度 400 mg·L－1）。

2.1.5 腎炎康復(fù)片入血原形成分 將空白組血清、給藥組血清和腎炎康復(fù)片的甲醇提取液中獲得對應(yīng)化合物的質(zhì)譜信息進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖1。根據(jù)色譜峰保留時(shí)間及質(zhì)譜碎裂規(guī)律，結(jié)合對照品對比和文獻(xiàn)相關(guān)信息，鑒定出腎炎康復(fù)片的入血原形成分21個(gè)，主要為皂苷類、環(huán)烯醚萜類、二萜類、生物堿類等，見表1。

表1 腎炎康復(fù)片入血成分鑒定Tab 1 Identification of components of Shenyan Kangfu tablets absorbed in the serum

圖1 腎炎康復(fù)片給藥血清UPLC-Q/TOF-MS總離子流圖Fig 1 UPLC-Q/TOF-MS total ion chromatogram of serum after the administration of Shenyan Kangfu tablets

環(huán)烯醚萜類化合物的質(zhì)譜裂解方式主要是糖苷鍵的斷裂后脫羰基、水，開環(huán)裂解以及去甲基等[6]。以化合物5為例，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z373.1118 [M-H]－，并且二級碎片離子分別為糖苷鍵斷裂后形成的m/z211.0598[M-H-C6H9O5]－，接著脫去羰基形成m/z167.0095[M-H-C6H9O5-CO2]－，最后開環(huán)裂解成m/z123.0438 [C7H7O2]－碎片離子。通過與對照品京尼平苷酸的質(zhì)譜信息及相關(guān)文獻(xiàn)[7]對比分析，鑒定其為京尼平苷酸，裂解途徑見圖2。

圖2 京尼平苷酸裂解途徑Fig 2 Fragmentation pathway of geniposidic acid

皂苷類化合物主要存在于人參中，結(jié)構(gòu)中主要含有多個(gè)糖基取代，質(zhì)譜裂解規(guī)律一般是逐級丟失糖基后產(chǎn)生一系列碎片離子，糖基主要包括葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖等。以化合物13為例，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z1107.5929 [M-H]－，其特征碎片離子為m/z945.5402、m/z783.4868、m/z621.4351、m/z459.3903，是準(zhǔn)分子離子連續(xù)失去4分子葡萄糖而產(chǎn)生的，通過與相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道比對分析，鑒定其為人參皂苷Rb1，裂解途徑見圖3。

圖3 人參皂苷Rb1裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of ginsenoside Rb1

二萜類化合物在正離子模式下的響應(yīng)較好，該類化合物的主要裂解特征是脫羰基，丟失水分子[10]。以化合物21為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z295.1334 [M＋H]＋，在裂解過程中易脫去1個(gè)H2O分子并繼續(xù)脫去CO，進(jìn)而形成m/z277.1227 [M＋H-H2O]＋和m/z249.1276[M＋H-H2O-CO]＋的碎片離子[11]，通過與對照品比對，鑒定為丹參酮ⅡA，裂解途徑見圖4。

圖4 丹參酮ⅡA裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of tanshinoneⅡA

2.2 腎炎康復(fù)片含量測定

2.2.1 含量測定指標(biāo)成分選擇 綜合考慮腎炎康復(fù)片中含量較高，可測性好的成分，以及“2.1”項(xiàng)下鑒定的入血原形成分，并盡量涵蓋更多的藥材選取含量測定指標(biāo)成分，選擇大豆苷、落新婦苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA為指標(biāo)成分。其中隱丹參酮、丹參酮ⅡA為入血原形成分。5種指標(biāo)成分中隱丹參酮、丹參酮ⅡA和丹酚酸B一起為丹參的主要成分[12]。大豆苷為黑豆的主要成分[13]，落新婦苷為土茯苓的主要成分[14]。

2.2.2 對照品儲備液的制備 分別精密稱取大豆苷、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、落新婦苷、隱丹參酮對照品適量，加甲醇制成每l mL含1 mg的對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（C）-0.1%甲酸水（D）；梯度洗脫（0～2 min：5%～25%C，2～30 min：25%～53%C，30～32 min：53%～79%C，32～48 min：79%～95%C）；流速：1 mL·min－1；柱溫：35℃；二極管陣列檢測器，檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2.5 專屬性的考察 用“2.2.2”項(xiàng)下對照品儲備液，加甲醇稀釋，配制成含大豆苷100 μg·mL－1、落新婦苷200 μg·mL－1、丹酚酸B 200 μg·mL－1、隱丹參酮100 μg·mL－1、丹參酮ⅡA 100 μg·mL－1的混合對照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖5，表明方法專屬性良好。

圖5 對照品（A）、供試品（B）和空白溶劑（C）的HPLC圖Fig 5 HPLC of reference substance（A），sample（B）and bank solvent（C）

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下各對照品儲備液，加甲醇制成稀釋成系列質(zhì)量濃度對照品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得各指標(biāo)成分的線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 5種成分的線性回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linearity of 5 components

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取 “2.2.2”項(xiàng)下對照品儲備液稀釋至相應(yīng)濃度，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，結(jié)果大豆苷、落新婦苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為1.9%、1.7%、1.7%、1.8%、1.7%，表明方法日內(nèi)精密度良好。取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每日1次，測得峰面積，結(jié)果大豆苷、落新婦苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為2.0%、1.9%、1.8%、1.8%、1.8%，表明方法日間精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（批號：17396）6 份，每份稱取約2 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果大豆苷、落新婦苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.66%、1.5%、1.9%、1.9%、2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.8”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄24 h內(nèi)峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果大豆苷、落新婦苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為 2.0%、1.6%、1.8%、1.5%、1.7%，表明樣品在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品（批號：17395，含大豆苷209.17 μg·g－1、落新婦苷2493.04 μg·g－1、丹酚酸B 3601.04 μg·g－1、隱丹參酮182.07 μg·g－1、丹參酮ⅡA 285.69 μg·g－1）約2 g，精密稱定，精密加入相當(dāng)于各成分含量的80%、100%、120%的對照品（n＝3），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算低、中、高濃度的平均加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表3。

表3 5種成分的加樣回收率(n＝3)Tab 3 Recovery of 5 components (n＝3)

表4 15批樣品中5種成分的含量(n＝3)Tab 4 Contents of 5 compounds in 15 batches of samples (n＝3)

2.2.11 樣品含量測定 取15批次腎炎康復(fù)片，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中大豆苷、落新婦苷、丹酚酸B、隱丹酮、丹參酮ⅡA含量，結(jié)果見表 4。

3 討論

3.1 血清藥物化學(xué)采血時(shí)間點(diǎn)的選擇

考慮到不同時(shí)間點(diǎn)的吸收入血成分可能存在差異，筆者通過預(yù)實(shí)驗(yàn)分別于小鼠灌胃給藥腎炎康復(fù)片藥液后30 min、1 h、2 h經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，置于含抗凝劑的離心管中，于3500 r·min－1、4℃離心10 min，分離血清，比較發(fā)現(xiàn)給藥30 min后的血清樣品檢測到的色譜峰最多，響應(yīng)值最強(qiáng)。故選擇給藥30 min后作為取血時(shí)間點(diǎn)。

3.2 含量測定指標(biāo)成分分析

本研究選擇的5種指標(biāo)成分的藥理作用與腎炎康復(fù)片治療腎炎、糖尿病腎病的功效密切相關(guān)。在藥理作用方面隱丹參酮、丹參酮ⅡA和丹酚酸B都具有心血管保護(hù)、抗炎、抗氧化等作用，丹酚酸B又具有降低血糖作用[15-19]。大豆苷屬于異黃酮類化合物具有保護(hù)心血管、治療糖尿病、預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[20]。落新婦苷具有抗炎、保肝護(hù)腎、抗糖尿病等作用[21]。

在腎炎康復(fù)片藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法鑒別了人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rgl、擬人參皂苷F11、鹽酸水蘇堿、丹參酮ⅡA成分和桔梗藥材；采用高效液相色譜法測定了丹參酮ⅡA的含量。本實(shí)驗(yàn)選擇的5種指標(biāo)成分含量測定，新增了黑豆和土茯苓中成分的含量測定，補(bǔ)充了丹參中隱丹參酮和丹酚酸B的含量測定，結(jié)合藥典的鑒別方法，更有利于腎炎康復(fù)片的整體質(zhì)量控制。

3.3 含量測定高效液相色譜條件的選擇

在色譜條件優(yōu)化過程中，先選擇了乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，但色譜圖中各峰的分離度較差，洗脫時(shí)間較長，后將乙腈換為甲醇，各色譜峰的峰形與分離度有了明顯改善；在270 nm下各指標(biāo)成分都有較大吸收且基線噪聲較小，故選擇270 nm為檢測波長。

3.4 含量測定結(jié)果分析

藥典規(guī)定腎炎康復(fù)片薄膜衣片每片含丹參酮ⅡA不得少于80 μg，去除薄膜衣后腎炎康復(fù)片每片0.45 g。含量測定結(jié)果顯示，各批次腎炎康復(fù)片丹參酮ⅡA的含量均符合藥典規(guī)定，但不同批次樣品中各成分的含量具有一定的差異，可能與不同批次樣品所使用原料藥材的批次、來源、采收期等因素有關(guān)。藥效成分含量的均一性和穩(wěn)定性是藥品臨床療效的重要保障。因此，建立多指標(biāo)成分含量測定方法，完善腎炎康復(fù)片的質(zhì)量控制方法，對于確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床安全用藥十分重要。