亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        黃芪多糖對(duì)急性放射性腸炎大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡及TXNIP/NLRP3軸的影響

        2023-06-07 06:39:38李浩田李鵬王玉鳳張春禮鄭州市第九人民醫(yī)院普外科鄭州450053河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院鄭州人民醫(yī)院普外二科鄭州450053
        中南藥學(xué) 2023年5期

        李浩田,李鵬,王玉鳳,張春禮(.鄭州市第九人民醫(yī)院普外科,鄭州 450053;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院普外二科,鄭州 450053)

        近年來,腫瘤放射治療已達(dá)成臨床共識(shí),且其治療逐漸規(guī)范。然而,隨著腫瘤發(fā)病率的增加和放射治療的普及,越來越多的患者在接受盆腔和腹部惡性腫瘤的放射治療后不可避免地發(fā)生急性放射性腸炎(acute radiation enteritis,ARE)[1]。ARE已成為腹部和盆腔惡性腫瘤放射性治療之后常見的腸道并發(fā)癥[2]。研究顯示,電離輻射可導(dǎo)致腸組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)腸黏膜細(xì)胞凋亡,是ARE形成的重要機(jī)制[3]。黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)是從中藥黃芪中提取的主要活性成分之一,有研究表明APS可有效治療三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[4],提示APS在腸炎中發(fā)揮著保護(hù)作用。但目前關(guān)于APS治療ARE的研究鮮有報(bào)道。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)/炎性小體3(NLR family pyrin domain containing 3,NLRP3)通路的激活與潰瘍性結(jié)腸炎腸道炎癥有關(guān)[5],但APS對(duì)ARE大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡及TXNIP/NLRP3軸的影響尚不清楚,因此,本研究擬構(gòu)建ARE大鼠模型,以探究APS對(duì)ARE大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡及TXNIP/NLRP3軸的影響。

        1 材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        72只體質(zhì)量為(200~250)g的健康雄性SD大鼠,購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0055]。所有大鼠均在無特定病原體的環(huán)境下飼養(yǎng),并在實(shí)驗(yàn)前一周提供自由飲水和飲食。大鼠被飼養(yǎng)在溫度為(25±2)℃,光照/黑暗周期為12 h的環(huán)境中。該動(dòng)物研究得到鄭州市第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):20200019),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則。

        1.2 試藥

        APS(純度:98%,批號(hào):20211223,上海吉至生化科技有限公司);柳氮磺吡啶腸溶片(批號(hào):20220102,上海信誼天平藥業(yè)有限公司);白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司);TUNEL檢測(cè)試劑盒、ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GAPDH兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔IgG二抗(廣州易錦生物技術(shù)有限公司);JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)(西安明克斯檢測(cè)設(shè)備有限公司)。

        2 方法

        2.1 造模及分組

        按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為6組,即對(duì)照組(NC組)、模型組(Model組)、黃芪多糖低劑量組(APS-L組)、黃芪多糖中劑量組(APS-M組)、黃芪多糖高劑量組(APS-H組)、陽(yáng)性藥物組(Positive組),每組12只。參考文獻(xiàn)[6]構(gòu)建ARE大鼠模型,即除NC組外,其余各組大鼠均給予3%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉后,將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,利用直線加速器對(duì)大鼠腹部(胸骨劍突至恥骨聯(lián)合處)進(jìn)行單次照射,照射源距離皮膚50 cm,總照射劑量為12 Gy,照射時(shí)間為3 min。照射后24 h內(nèi)若觀察到大鼠出現(xiàn)腹瀉、稀便、血便等癥狀則表明造模成功。造模24 h后,參考文獻(xiàn)[7]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)APS-L組、APS-M組、APS-H組大鼠分別按照100、200、400 mg·kg-1APS的劑量進(jìn)行灌胃,Positive組大鼠按照300 mg·kg-1柳氮磺吡啶的劑量進(jìn)行灌胃,NC組及Model組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃15 d。

        2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

        末次給藥24 h后,參照文獻(xiàn)[8],根據(jù)大鼠體質(zhì)量、糞便性狀和糞便潛血情況進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分,包括體質(zhì)量下降(0分:<1%;1分:1%~5%;2分:6%~10%;3分:11%~15%;4分:>15%),大便性狀(0分:正常;1分:軟便成形,不黏附肛門;2分:軟便成形,黏附肛門;3分:腹瀉),糞便潛血(0分:正常;1分:糞便中有暗紅色斑點(diǎn);2分:肛門可見出血;3分:糞便中有深紅色斑點(diǎn),肛門有血液黏附)。DAI的計(jì)算公式如下:DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+糞便潛血分?jǐn)?shù))/3。

        2.3 標(biāo)本收集

        DAI評(píng)分測(cè)定完成后,處死大鼠,取大鼠腸黏膜組織,分為兩部分(每部分包含各組6只大鼠的腸黏膜組織),一部分固定于4%多聚甲醛中用于蘇木精-伊紅(HE)、TUNEL染色,另一部分在液氮中迅速冷凍后保存于-80℃中用于ELISA、qRT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)。

        2.4 HE染色

        將各組大鼠腸黏膜組織在4%多聚甲醛中固定24 h后,石蠟包埋后將組織切成5 μm的切片并用HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察HE染色切片的病理形態(tài)變化。

        2.5 ELISA法檢測(cè)各組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α的含量

        取各組大鼠腸黏膜組織,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4),用組織搗碎機(jī)以15 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速將腸黏膜組織勻漿,并在4℃下以10 000 r·min-1離心10 min,收集上清液,利用BCA試劑盒檢測(cè)上清液蛋白濃度,測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)組樣本的吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸,OD值為Y軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)驗(yàn)組樣本IL-6、TNF-α含量。

        2.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

        將大鼠腸黏膜組織的石蠟包埋切片脫蠟并用乙醇梯度脫水至水化,利用TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡情況,利用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察,細(xì)胞核染色為棕黃色的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)×100%。

        2.7 qRT-PCR檢測(cè)大鼠腸黏膜組織中相關(guān)因子mRNA的表達(dá)

        使用TRIzol試劑提取腸黏膜組織勻漿中總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行定量反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-ΔΔCt法計(jì)算TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

        表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

        2.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)

        利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解腸黏膜組織,在4℃下以10 000 r·min-1離心10 min收集蛋白質(zhì)裂解物,并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離30 μg蛋白質(zhì),電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后,將膜與Bax(1∶2000)、Caspase-3(1∶2000)、TXNIP(1∶1000)、NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶1000)、IL-1β(1∶2000)、IL-18(1∶3000)、GAPDH(1∶2500)抗體在4℃下孵育過夜。隨后,將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔(1∶5000)二抗在室溫下孵育2 h。使用ECL發(fā)光試劑盒觀察蛋白質(zhì)條帶,以GAPDH為內(nèi)部參照,利用Image J軟件掃描蛋白條帶的灰度值。

        2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 APS對(duì)各組大鼠DAI的影響

        經(jīng)單因素方差分析,6組大鼠的DAI差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=250.696,P<0.01,n=12)。行SNK-q檢驗(yàn),與NC組比較,Model組大鼠DAI評(píng)分[(2.86±0.32)分]顯著升高(P<0.05);與Model組比較,APS-L組[(2.05±0.29)分]、APS-M組[(1.54±0.27)分]、APS-H組[(0.97±0.12)分]、Positive組[(0.89±0.11)分]大鼠DAI顯著降低(P<0.05),且APS濃度越高,DAI越低。

        3.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化

        NC組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,無明顯病理變化;與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜損傷嚴(yán)重,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩及上皮破壞等現(xiàn)象;與Model組比較,APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜損傷程度明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,隱窩及上皮受損逐漸恢復(fù),且APS濃度越高,對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)越明顯,見圖1。

        圖1 HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化(×200)Fig 1 Histopathological changes of rat colon by HE staining(×200)

        3.3 APS對(duì)各組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量的影響

        與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量顯著升高(P均<0.05);與Model組比較,APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量顯著降低(P均<0.05),且APS濃度越高,IL-6、TNF-α含量越低,見圖2。

        圖2 APS對(duì)各組大鼠腸黏膜中IL-6、TNF-α含量的影響Fig 2 Effect of APS on the content of IL-6 and TNF-α in the intestinal mucosa of rats in each group

        3.4 APS對(duì)各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響

        與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率及腸黏膜組織中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著顯著升高(均P<0.05);與Model組比較,APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率及腸黏膜組織中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05),且APS濃度越高,上述指標(biāo)對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)越明顯,見圖3~5。

        圖3 TUNEL檢測(cè)APS對(duì)各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響(×400)Fig 3 Effect of APS on the apoptosis of the intestinal mucosal cells of rats in each group by TUNEL(×400)

        圖4 APS對(duì)各組大鼠腸黏膜組織中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of APS on the expression of Bax and Caspase-3 protein in intestinal mucosa of rats in each group

        圖5 APS對(duì)各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響Fig 5 Effect of APS on the apoptosis of the intestinal mucosal cells in each group

        3.5 APS對(duì)TXNIP/NLRP3通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響

        與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05);與Model組比較,APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表達(dá)水平顯著降低(P均<0.05),且APS濃度越高,上述指標(biāo)對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)越明顯,見圖6。

        圖6 APS對(duì)各組大鼠TXNIP/NLRP3通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響Fig 6 Effect of APS on the mRNA expression level of TXNIP/NLRP3 related pathways of the intestinal mucosal cells in various rat groups

        3.6 APS對(duì)TXNIP/NLRP3通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

        與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05);與Model組比較,APS-L組、APS-M組、APS-H組、Positive組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平顯著降低(P均<0.05),且APS濃度越高,上述指標(biāo)對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)越明顯,見圖7。

        圖7 APS對(duì)各組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effect of APS on the protein expression of TXNIP,NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18 in the intestinal mucosa of rats in each group

        4 討論

        腹部和盆腔經(jīng)輻射后引起的ARE是臨床中常見且嚴(yán)重的問題,其臨床表現(xiàn)通常包括腹痛、腹瀉、血便、敗血癥、全身炎癥和多器官功能障礙綜合征等[9-10]。目前,對(duì)于ARE的治療只是對(duì)癥治療[11]。隨著該疾病的發(fā)展,它會(huì)引起腸道纖維化和閉塞性動(dòng)脈內(nèi)膜炎,并導(dǎo)致高死亡率[12]。最近的研究顯示,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是放射性腸炎形成的重要機(jī)制,其中與ARE密切相關(guān)的凋亡基因有Caspase-3、Bax等[13];輻射可使腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞[14]。本研究發(fā)現(xiàn),與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜損傷嚴(yán)重,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩及上皮被破壞等現(xiàn)象,DAI評(píng)分、炎性因子(IL-6、TNF-α)含量、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)顯著升高,提示ARE大鼠腸黏膜病理?yè)p傷嚴(yán)重,且存在炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。

        黃芪,含有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸等成分,可促進(jìn)抗體產(chǎn)生和免疫反應(yīng)[15]。APS是從黃芪中提取的有效成分之一,具有多種藥理作用,包括調(diào)節(jié)免疫功能、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗纖維化、抗菌、防輻射和抗病毒等[16]。據(jù)報(bào)道,APS能通過激活A(yù)kt/mTOR通路調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),對(duì)缺氧/復(fù)氧所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡起到抑制作用[17];APS能夠顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)炎癥水平,促進(jìn)結(jié)腸組織病理學(xué)恢復(fù)[7];APS能可改善潰瘍性結(jié)腸炎中稀便、血便及體質(zhì)量下降等癥狀,并且可維持腸黏膜和腸上皮的完整性,減輕炎癥反應(yīng)程度[18]。而關(guān)于APS對(duì)ARE大鼠的影響尚未見報(bào)道,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Model組比較,APS各劑量組及Positive組大鼠腸黏膜損傷程度明顯減輕,DAI評(píng)分、炎性因子(IL-6、TNF-α)含量、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)顯著降低,提示APS可抑制ARE大鼠腸黏膜組織分泌炎性因子及腸黏膜細(xì)胞凋亡,對(duì)ARE具有明顯的改善作用。

        TXNIP/NLRP3通路的激活與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。經(jīng)多種內(nèi)源性損傷信號(hào)(如活性氧)刺激后,TXNIP表達(dá)上調(diào),促進(jìn)其與NLRP3結(jié)合及NLRP3炎性復(fù)合體的形成,進(jìn)一步激活Caspase-1,進(jìn)而介導(dǎo)炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌[19-20]。崔勇和等[21]報(bào)道白藜蘆醇通過抑制TXNIP/NLRP3信號(hào)通路改善脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷;An等[22]發(fā)現(xiàn)安石榴苷通過調(diào)控TXNIP/NLRP3通路抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用。以上研究表明,抑制TXNIP/NLRP3通路可減輕炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,而關(guān)于TXNIP/NLRP3通路在ARE中發(fā)揮何種效應(yīng)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),與NC組比較,Model組大鼠腸黏膜組織中TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示TXNIP/NLRP3通路可能參與了ARE的發(fā)生;與Model組比較,APS各劑量組及Positive組大鼠腸黏膜組織中上述mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低,且APS濃度越高,上述蛋白表達(dá)越低。提示APS可抑制ARE大鼠腸黏膜組織炎性因子的分泌及腸黏膜細(xì)胞凋亡,可能與抑制TXNIP/NLRP3通路有關(guān)。然而,本研究未在APS作用的基礎(chǔ)上再加上TXNIP/NLRP3通路激活劑來干預(yù)ARE大鼠來驗(yàn)證APS是否通過調(diào)控TXNIP/NLRP3通路來抑制ARE大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡是本研究的不足之處,后期將會(huì)在機(jī)制探討中作重要研究,以便更深入地挖掘APS抑制ARE大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。

        綜上所述,APS可抑制ARE大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡,該機(jī)制可能與抑制TXNIP/NLRP3軸有關(guān)。本研究初步了解TXNIP/NLRP3軸在ARE中的作用,為臨床應(yīng)用APS及靶向治療ARE提供了理論依據(jù),但APS抑制ARE大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制較為復(fù)雜,有待進(jìn)一步深入研究。

        精品国产免费Av无码久久久| 日本国产成人国产在线播放| 伊人五月亚洲综合在线| 国内自拍情侣露脸高清在线| 久久精品免费观看国产| 中文字幕少妇AV| 最新欧美一级视频| 在线不卡精品免费视频| 亚洲一区二区三区四区五区黄| 国产一区二区三区影院| 久久亚洲第一视频黄色| 久久亚洲精品一区二区三区| 奶头又大又白喷奶水av| 精品香蕉久久久午夜福利| 欧洲亚洲色一区二区色99| 日本一区二区三区高清视| 成人午夜福利视频| 欧美亚洲国产精品久久高清| 日本精品久久性大片日本| 青青草手机在线免费观看视频 | 丰满人妻被黑人猛烈进入| 国产精品无码无片在线观看3D| 国产偷国产偷亚洲高清| 色哟哟最新在线观看入口| 国产a v无码专区亚洲av| 国产美女三级视频网站| 婷婷久久精品国产色蜜蜜麻豆| 欧美黑吊大战白妞| 亚洲国产一区二区三区最新| 国产精品毛片一区二区三区| 国产电影一区二区三区| 国产亚洲蜜芽精品久久| 精品视频一区二区在线观看| 99re6在线视频精品免费| 国产成人久久777777| 人妻精品一区二区免费| 男女射黄视频网站在线免费观看 | 亚洲欧美另类激情综合区| 99精品国产自产在线观看| 天堂蜜桃视频在线观看| 中国丰满熟妇xxxx性|