程永芳，段慧明（廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點實驗室，南寧 530200）

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率高。美國癌癥協(xié)會發(fā)布的癌癥統(tǒng)計分析報告顯示，全球HCC發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別排第6位和第3位，主要分布在亞洲和非洲等[1-2]。由于肝癌早期不易被察覺，其轉(zhuǎn)移快且隱蔽，大多數(shù)肝癌患者確診時已到中晚期，并且我國肝癌患者大多在確診時還伴隨有嚴(yán)重的肝硬化，目前的多種治療手段包括手術(shù)放化療、靶向治療、免疫治療甚至聯(lián)合治療均未能改變其預(yù)后差、5年生存率低等特征。外泌體研究的興起，深入研究外泌體在肝癌中的作用機制，將為肝癌的早期診斷、治療和預(yù)后的評估開辟新的途徑。

外泌體是一種幾乎所有類型細胞（包括腫瘤細胞）都會分泌的，直徑為30～100 nm的小囊泡[3]。它們富含來自親代細胞的選擇性蛋白質(zhì)和核酸，具有標(biāo)志蛋白（CD81、CD9、CD63、TSG101、ALIX等）[4]，可傳遞關(guān)鍵成分，具有調(diào)節(jié)細胞間通信的潛力，并且是通過“運輸”分子來調(diào)節(jié)細胞過程的關(guān)鍵信使。外泌體可以傳遞蛋白質(zhì)、可溶性因子，最重要的是可以傳遞調(diào)節(jié)受體細胞蛋白表達的RNA和microRNAs（miRNAs）[5]。這對于機體的正常穩(wěn)態(tài)和各種疾病包括腫瘤的發(fā)病機制都是非常重要的[6]。腫瘤來源的外泌體可能有助于腫瘤微環(huán)境的募集和重編程以形成促致瘤的土壤。腫瘤來源的外泌體可改變局部和全身微環(huán)境，通過將其內(nèi)容物（如EGFRVIII、KRAS、lncRNAs或miRNAs等）轉(zhuǎn)移到其他腫瘤細胞以誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，遷移和侵襲或受體細胞耐藥，從而促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移并可通過TGF-β1或其他配體的分泌抑制腫瘤細胞凋亡[7-10]，本研究通過對HepG2肝癌細胞系外泌體的分離及分析，揭示外泌體在肝癌進展中的作用。

1 材料

1.1 細胞

HepG2細胞株，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 試藥

DMEM高糖培養(yǎng)基（凱基生物）；胎牛血清（四季青）；兔CD9、TSG101、ALIX單克隆抗體及HRP-山羊抗兔二抗（Servicebio）；胰蛋白酶（Solarbio）；PBS緩沖液（凱基生物）；CCK-8試劑盒（Beyotime）；Caspase3/7細胞凋亡活性檢測試劑盒“綠色熒光”（上海生工）；BCA蛋白定量試劑盒（南京建成）。

1.3 儀器

MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本PHCbi公司）；CP100NX超速冷凍離心機、HT7800/HT7700透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；Infinite M200Pro Nanoquant光吸收微孔板熒光檢測儀（瑞士TECAN公司）；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將HepG2肝癌細胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中。種板24 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基[11]，將細胞置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

2.2 外泌體提取

待細胞狀態(tài)良好且生長至1×107～1×108，收集細胞培養(yǎng)上清液用以提取外泌體。4℃，300×g離心10 min，去除細胞污染。吸取上清液于2000×g離心10 min，去除死細胞。吸取上清液于10 000×g離心30 min，去除細胞碎片，吸取上清液于100 000×g超速離心90 min，去除上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后于100 000×g超速離心90 min，沉淀即為外泌體[12]。PBS重懸，BCA法測定蛋白濃度，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 電鏡觀察

用移液槍吸取外泌體20 μL滴在碳膜銅網(wǎng)放置5 min，用濾紙吸去多余液體。將2% 磷鎢酸滴在碳膜銅網(wǎng)上放置2 min，用濾紙吸去多余液體，室溫干燥。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.4 外泌體定性檢測

取出凍存的外泌體，室溫下冰上放置融化3 min，取出10 μL分離出的外泌體，加入5 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，振蕩混勻，室溫放置10 min，4℃下20 000×g離心20 min。上清液為蛋白裂解液，取10 μL裂解液加入5×loading buffer，95℃加熱5 min，冷卻，經(jīng)12%SDS-PAGE 150 V恒壓跑膠1.5 h，15 V恒壓轉(zhuǎn)膜，于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶（0.5%TBST配）封閉1 h，加入1∶1000稀釋兔抗人CD9、TSG101、ALIX單克隆抗體，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠圖像分析。

2.5 肝癌細胞增殖檢測（CCK-8法）

收集處于對數(shù)生長期細胞，接種至96孔板中（2500細胞/孔），種板24 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，加入外泌體（300 μg·mL－1）10 μL共孵育作為外泌體組，用等體積的PBS處理的細胞作為對照組，沒有細胞的小孔加入等體積PBS作空白組。每組設(shè)置3個復(fù)孔，細胞培養(yǎng)24～72 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，再孵育1 h，450 nm處測定吸光度值。

2.6 熒光法檢測外泌體對細胞凋亡的影響

收集處于對數(shù)生長期細胞，接種至96孔板中（2250細胞/孔），種板24 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，加入外泌體（206 μg·mL－1）20 μL共孵育48 h作為外泌體組。對照組未作共培養(yǎng)處理，用Caspase3/7細胞凋亡活性檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況（酶標(biāo)儀檢測Ex/Em＝490/525 nm處的熒光強度）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析作圖，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 外泌體的形態(tài)觀察

用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)，一般為圓形或橢圓形膜性囊泡，直徑30～100 nm，見圖1。

圖1 透射電子顯微鏡下觀察到的外泌體形態(tài)（×40 000）Fig 1 Morphology of exosomes under transmission electron microscope（×40 000）

3.2 外泌體標(biāo)志物的檢測

對HepG2細胞分泌的外泌體作Western blot定性分析，可見外泌體穩(wěn)定表達CD9、TSG101、ALIX等蛋白標(biāo)志物，見圖2。

圖2 外泌體標(biāo)志物的表達Fig 2 Expression of exosomal markers

3.3 外泌體對腫瘤細胞增殖的影響

以CCK-8法檢測加入外泌體處理后的腫瘤細胞的增殖趨勢，可發(fā)現(xiàn)外泌體具有促進腫瘤細胞增殖的能力，但72 h相比48 h細胞吸光度值有所減少，見表1。

表1 CCK-8法檢測細胞不同時間點吸光度值( ±s，n＝3)Tab 1 Absorbance of cells at different time measured by CCK-8 method ( ±s，n＝3)

表1 CCK-8法檢測細胞不同時間點吸光度值( ±s，n＝3)Tab 1 Absorbance of cells at different time measured by CCK-8 method ( ±s，n＝3)

注：與對照組比較，#P＜0.01。Note：Compared with the control group，#P＜0.01.

組別吸光度值24 h48 h72 h對照組0.280±0.0290.437±0.0060.384±0.026外泌體組0.284±0.0190.514±0.0640.474±0.020#

3.4 外泌體對腫瘤細胞凋亡的影響

采用綠色熒光法（Caspase3/7細胞凋亡活性檢測試劑盒）檢測細胞凋亡的水平，可發(fā)現(xiàn)相比于對照組，外泌體具有抑制腫瘤細胞凋亡的作用，但不顯著，見圖3。

圖3 外泌體對HepG2細胞凋亡的影響（n＝3）Fig 3 Effects of exosomes on apoptosis of HepG2 cells（n＝3）

4 討論

外泌體是近些年國內(nèi)外研究的熱點，尤其在腫瘤方面應(yīng)用廣泛，越來越多的證據(jù)表明，來源于腫瘤細胞的外泌體在癌癥中起著關(guān)鍵作用[13]，本研究主要探索肝癌細胞外泌體對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。

本研究采用多步超速離心法從肝癌HepG2細胞的培養(yǎng)液上清液中分離出外泌體（因考慮最大限度利用外泌體，同時為了防止其降解，外泌體是分批次提取，每次實驗提取一次）并通過透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，利用Western blot檢測其標(biāo)志物的表達。采用CCK-8法、綠色熒光法分別檢測外泌體對HepG2細胞增殖和凋亡的影響。

多步超速離心分離外泌體是最常見的外泌體提取方法，100 000×g超速離心，時間在70 min以上是多步離心的關(guān)鍵步驟。最后PBS溶解后的外泌體可以直接使用不影響后續(xù)實驗，而不需要在使用前過濾除菌，過濾很容易使外泌體濃度降低，因為外泌體直徑與濾膜孔徑接近，不易濾過。

電鏡觀察到的外泌體一般為圓形或橢圓形膜性囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑在200 nm以下，也有直徑在200 nm以上的其他微泡和凋亡小體等，外泌體具有標(biāo)志性蛋白CD9、TSG101、ALIX等。外泌體的電鏡觀察證明提取到的囊泡從形態(tài)和大小上符合外泌體的描述，但還不能完全證實就是外泌體，只是初步驗證，而Western blot檢測到外泌體的標(biāo)志性蛋白則更進一步從結(jié)構(gòu)成分上驗證了外泌體的存在。

CCK-8法顯示外泌體對HepG2細胞具有促增殖作用，24 h和48 h效果較弱且48 h細胞量要高于72 h，可能細胞在生長到72 h時營養(yǎng)下降，導(dǎo)致細胞量下降的作用可能逐漸超過增殖作用，原因可能是種板時采用的是含10%血清的高糖DMEM，而在外泌體處理前（即種板24 h后）將含10%血清的高糖DMEM換成了含1%血清的高糖DMEM（血清濃度高會影響增殖），但濃度低了又會導(dǎo)致后續(xù)營養(yǎng)不足，也可能是種板時三塊板上的細胞未處在同一個生長期導(dǎo)致，需要更好的優(yōu)化生長條件并對培養(yǎng)基進一步摸索條件使其在進入第3日時還能保持很好的營養(yǎng)，為了有更好的效果同時還應(yīng)進一步加大外泌體的提取濃度。

綠色熒光法檢測用外泌體共培育的HepG2細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示外泌體有一定的抑制HepG2細胞凋亡的作用，但幅度不大，作用不顯著，這可能和本批次提取的外泌體濃度（質(zhì)量濃度為206 μg·mL－1）不高有關(guān)。

增殖和凋亡是外泌體功能的一體兩面，能促進增殖就能抑制凋亡。促進增殖的作用強，必定抑制凋亡的作用也強，反之亦然，促增殖能力弱必定抑制凋亡能力也弱。而本研究促增殖能力要稍強于抑制凋亡能力，沒有較好表現(xiàn)出兩種作用強度的一致性，很可能是由于外泌體是分批次提取，導(dǎo)致濃度的差異，因此體外實驗也應(yīng)盡量接近體內(nèi)這種作用的統(tǒng)一性，最好所有實驗都采用一次提取的外泌體，這樣能保證增殖和凋亡實驗都是采用同一濃度的外泌體，但是這樣也會導(dǎo)致一次收集的細胞工作量過大的問題，而且，外泌體長時間低溫保存也會導(dǎo)致外泌體的降解，因此需要找到一個合理的濃度。

綜上，本研究從肝癌細胞的培養(yǎng)液中提取到的外泌體（其濃度還應(yīng)進一步提高），具有促進肝癌細胞增殖和抑制其凋亡的能力。