陳義波，龍玲，范幸，林蓓蓓（長(zhǎng)沙市婦幼保健院婦科，長(zhǎng)沙 410007）

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)最新全球癌癥年報(bào)報(bào)道，我國(guó)2020年新發(fā)宮頸癌病例11萬例，其中死亡病例數(shù)近6萬例[1]，嚴(yán)重危害女性健康。Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白（Wilms'tumor 1 associating protein，WTAP）作為一種致癌分子，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明WTAP在胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，具有腫瘤特異性和促癌效應(yīng)[3-4]，但其在宮頸癌中的作用尚未見明確報(bào)道。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程極其復(fù)雜，細(xì)胞增殖失控在其中起重要作用[5]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT serine/threonine kinase，AKT）作為細(xì)胞存活和代謝過程的一種絲氨酸蘇氨酸激酶，在細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[6]。AKT信號(hào)通路的激活能夠調(diào)節(jié)大量下游靶分子，影響宮頸癌細(xì)胞增殖[7]。N6甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修飾是最常見的RNA轉(zhuǎn)錄后修飾之一，影響RNA的剪接、翻譯和穩(wěn)定性[8]。m6A參與宮頸癌細(xì)胞增殖的調(diào)控，但作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶關(guān)鍵組分的WTAP在宮頸癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用暫無報(bào)道。本研究旨在探討WTAP與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系以及在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況，并在HeLa細(xì)胞中敲低或過表達(dá)WTAP，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響及探討其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料

人正常宮頸上皮細(xì)胞HUCEC、宮頸癌SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（美國(guó)Gibco公司），CCK8試劑盒和結(jié)晶紫染料（北京蘭杰柯科技有限公司）。靶向WTAP的siRNA和對(duì)照siRNA（NC siRNA）（廣州銳博生物公司），對(duì)照質(zhì)粒（empty vector）和WTAP過表達(dá)質(zhì)粒（WTAPOE vector）（武漢淼靈生物科技有限公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（美國(guó)Invitrogen公司），抗WTAP、p-AKT、AKT和G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)物5（Regulator of G Protein Signaling 5，RGS5）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），m6A抗體（美國(guó)Abcam公司），PrimeScript RT reagent Kit和TB Green Premix Ex Taq（日本Takara公司）。

2 方法

2.1 生物信息學(xué)資料分析

通過OncoLnc數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncolnc.org）和Cancer RNA-Seq Nexus（CRN）數(shù)據(jù)庫（https：//syslab4.nchu.edu.tw），采用COX回歸法進(jìn)行WTAP表達(dá)高/低表達(dá)組的宮頸癌生存分析，數(shù)據(jù)庫中宮頸癌資料均來源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HUCEC、SiHa和HeLa細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液、0.125%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組

HeLa細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待密度達(dá)50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，按Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，利用Western blot檢測(cè)WTAP蛋白表達(dá)水平，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照siRNA組（NC siRNA）、WTAP-siRNA組（WTAPsiRNA）、對(duì)照質(zhì)粒組（Empty vector）、WTAP過表達(dá)質(zhì)粒組（WTAPOE vector）。

2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖

將HeLa細(xì)胞依照不同分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理48 h后，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，48 h后每孔加入CCK8試劑10 μL，37℃孵育1 h后通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度值[9]，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖

將HeLa細(xì)胞依照不同分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理48 h后，按1×103個(gè)/孔接種于35 mm培養(yǎng)皿，每組3個(gè)復(fù)孔，每隔2～3 d換液，14 d后4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色液體染色10 min后拍照，記錄克隆形成數(shù)量[10]，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

將細(xì)胞依照不同分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理48 h后，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，48 h后用RIPA裂解細(xì)胞收集總蛋白并進(jìn)行BCA定量，煮沸5 min蛋白變性。取20 μg總蛋白通過10%的SDSPAGE膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜并用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，WTAP、p-AKT、AKT或RGS5一抗（1∶2000）4℃孵育過夜，洗膜5次，二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光采集圖像及灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，各組蛋白表達(dá)水平＝各目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值[11]。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 m6A-IP-qPCR檢測(cè)RGS5 m6A水平

將HeLa細(xì)胞依照不同分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理48 h后，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，48 h后用Trizol裂解細(xì)胞收集總RNA并分為2份，分為用于Input和m6A抗體IP富集m6A修飾的RNA，再逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增成cDNA[12]，qPCR檢測(cè)RGS5水平，程序?yàn)?5℃ 10 s、60℃ 34 s、72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。RGS5引物由上海生工生物公司合成，根據(jù)RGS5 mRNA序列，在Primer3在線數(shù)據(jù)庫（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)RGS5 mRNA的引物，序列為Forward primer（5'-GACATGGCCCAGAAAAGAATC-3'）和Reverse primer（5'-CACAAAGCGAGGCAGAGAATC-3'），并進(jìn)一步在Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）上比對(duì)證明其擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Log-rank檢驗(yàn)分析WTAP表達(dá)與宮頸癌生存的相關(guān)性。采用GraphPad Prism 8軟件處理數(shù)據(jù)及繪圖，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，其中兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 WTAP基因表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后關(guān)系

通過OncoLnc數(shù)據(jù)庫和Cancer RNA-Seq Nexus（CRN）數(shù)據(jù)庫分別分析WTAP基因表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，WTAP高表達(dá)組宮頸癌患者總生存期顯著低于WTAP低表達(dá)患者，Log-rank檢驗(yàn)P＝0.0412（OncoLnc）和0.078（CRN），見圖1。

圖1 WTAP基因表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后關(guān)系Fig 1 Relationship between WTAP gene expression and prognosis of patients with cervical cancer

3.2 正常宮頸上皮細(xì)胞HUCEC和宮頸癌細(xì)胞WTAP蛋白表達(dá)

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常宮頸上皮細(xì)胞HUCEC、宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞的WTAP蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與HUCEC相比，SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞WTAP蛋白表達(dá)顯著高表達(dá)（P＜0.05），HeLa細(xì)胞中WTAP蛋白升高更顯著，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，見圖2。

圖2 正常宮頸上皮細(xì)胞（HUCEC）和宮頸癌細(xì)胞WTAP蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of WTAP protein in HUCEC and cervical cancer cells

3.3 HeLa細(xì)胞WTAP siRNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h的HeLa細(xì)胞的WTAP蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照siRNA（NC siRNA）組相比，WTAPsiRNA組WTAP蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與對(duì)照質(zhì)粒組相比，WTAP過表達(dá)質(zhì)粒組WTAP蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 HeLa細(xì)胞中WTAP siRNA和過表達(dá)效果Fig 3 Effect of WTAP siRNA and its overexpression in HeLa cells

3.4 WTAP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

通過CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照siRNA組相比，WTAPsiRNA組細(xì)胞CCK8的OD450nm值顯著降低、細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與對(duì)照質(zhì)粒組相比，WTAP過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞CCK8的OD450nm值顯著升高、細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著增多（P＜0.05），見圖4。

圖4 WTAP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Effect of WTAP on the proliferation of HeLa cells

3.5 WTAP對(duì)HeLa細(xì)胞AKT磷酸化和RGS5表達(dá)的影響

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞p-AKT、AKT和RGS5情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照siRNA組相比，WTAP-siRNA組AKT磷酸化水平（p-AKT/AKT）顯著降低，RGS5表達(dá)顯著增多（P＜0.05）；與對(duì)照質(zhì)粒組相比，WTAP過表達(dá)質(zhì)粒組AKT磷酸化水平顯著升高，RGS5表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 WTAP對(duì)HeLa細(xì)胞AKT磷酸化和RGS5表達(dá)的影響Fig 5 Effect of WTAP on AKT phosphorylation and RGS5 expression of HeLa cells

3.6 WTAP對(duì)HeLa細(xì)胞RGS5 m6A水平的影響

通過m6A-IP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞RGS5m6A水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照siRNA組相比，WTAP-siRNA組RGS5m6A水平降低（P＜0.05）；與對(duì)照質(zhì)粒組相比，WTAP過表達(dá)質(zhì)粒組RGS5m6A水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 WTAP對(duì)HeLa細(xì)胞RGS5 m6A水平的影響Fig 6 Effect of WTAP on RGS5 m6A level of HeLa cells

4 討論

宮頸癌發(fā)病率在我國(guó)女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌，近年來，宮頸癌發(fā)病率上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。盡管宮頸細(xì)胞學(xué)篩查在一定程度上能降低宮頸癌患者死亡率，但其在女性健康方面仍是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)[13]。RNA修飾種類多達(dá)100多種，其中m6A修飾是真核生物中最為普遍的修飾形式，在組織發(fā)育、細(xì)胞更新和分化、損傷應(yīng)答等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。m6A和癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也十分密切[14]。WTAP作為一種重要的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，最初被鑒定為與Wilms腫瘤1蛋白結(jié)合的剪接因子[15]，在許多腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[16]，研究報(bào)道顯示它能夠調(diào)節(jié)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的遷移與侵襲，在急性白血病中也被認(rèn)為是一種致癌基因，還能作為膠質(zhì)瘤耐預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)[17-18]。

本文首先通過腫瘤公共數(shù)據(jù)庫挖掘WTAP與宮頸癌患者生存期的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示W(wǎng)TAP高表達(dá)組宮頸癌患者總生存期明顯低于WTAP低表達(dá)患者。并進(jìn)一步比較正常宮頸上皮細(xì)胞HUCEC、宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞中WTAP蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞中WTAP蛋白顯著升高，提示W(wǎng)TAP在宮頸癌中同樣高表達(dá)，且可能起致癌作用。本研究結(jié)果表明，利用siRNA敲低WTAP后，HeLa細(xì)胞增殖明顯受限；而過表達(dá)WTAP則顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道敲低WTAP會(huì)抑制腎癌腫瘤細(xì)胞增殖的結(jié)果類似[19]。

AKT是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，針對(duì)AKT信號(hào)通路“關(guān)鍵點(diǎn)”的小分子抑制劑在抗腫瘤方面已取得明顯的應(yīng)用效果[20]。研究報(bào)道顯示宮頸癌組織中p-AKT的表達(dá)顯著增高，且隨著疾病的進(jìn)展表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與宮頸癌的分化及分期相關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，敲低WTAP抑制AKT活化，而過表達(dá)WTAP促進(jìn)AKT活化，這與已有研究報(bào)道的WTAP能激活A(yù)KT通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的結(jié)果類似[22]。

G蛋白偶聯(lián)受體的激活能夠調(diào)控AKT信號(hào)通路[23]，RGS5作為GTP酶激活劑調(diào)節(jié)異源三聚體G蛋白，能夠鈍化AKT信號(hào)通路而影響細(xì)胞活力[24]。本研究結(jié)果顯示，敲低WTAP促進(jìn)RGS5表達(dá)，而過表達(dá)WTAP抑制RGS5表達(dá)?？紤]到WTAP作為一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶[25]，Chen等[26]報(bào)道WTAP能夠通過m6A修飾HMBOX1而促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生。本文選用m6A-IP-qPCR進(jìn)行WTAP是否調(diào)控RGS5的m6A修飾分析，m6A-IP-qPCR是一種利用m6A抗體富集m6A修飾的RNA并進(jìn)行qPCR定量分析檢測(cè)方法，本文研究結(jié)果顯示敲低WTAP后RGS5的m6A修飾減少，而過表達(dá)WTAP則促進(jìn)RGS5的m6A修飾，提示W(wǎng)TAP能影響RGS5的m6A修飾，但具體m6A修飾的位點(diǎn)和區(qū)域仍需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本研究利用腫瘤生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析WTAP與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性情況，并在細(xì)胞水平證實(shí)宮頸癌細(xì)胞WTAP蛋白高表達(dá)，并進(jìn)一步明確WTAP促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)RGS5的m6A修飾繼而影響AKT信號(hào)通路活化有關(guān)，這為以WTAP及其調(diào)控的通路作為潛在靶標(biāo)治療宮頸癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。