唐木蘭，曾春暉，黃鑫波，王溢，朱海濱，楊柯（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指繼發(fā)于非心源性呼吸窘迫的低氧血癥-原發(fā)性肺水腫。ALI隨著病情進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），病死率高達(dá)30%～50%[1-2]。巨噬細(xì)胞在炎癥發(fā)生過程和免疫系統(tǒng)激活起到關(guān)鍵作用，其具有可塑性和功能多樣性，可以極化為M1或M2亞型。M1 型巨噬細(xì)胞與促炎有關(guān)，而 M2型巨噬細(xì)胞則與抗炎、傷口愈合及纖維化作用相關(guān)[3-4]。已有研究證實(shí)，在ALI/ARDS急性滲出期M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，因此巨噬細(xì)胞可被作為治療ALI/ARDS的靶細(xì)胞。

藤茶[Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang]系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的嫩莖葉，含有豐富的黃酮類化合物，以雙氫楊梅樹皮素為主[5]。課題組前期實(shí)驗(yàn)已證明藤茶能顯著增加小鼠胸腺、脾臟等免疫器官的重量[6-7]，具有增強(qiáng)非特異性免疫功能和體液免疫功能的作用；前期研究也表明雙氫楊梅樹皮素具有抵抗博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化作用，改善呼吸功能衰退的癥狀[8]。本文構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，提示雙氫楊梅樹皮素可通過PI3K-Akt信號(hào)通路改善ALI，且進(jìn)行巨噬細(xì)胞極化差異基因KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的極化也與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取PI3K/Akt信號(hào)通路的主要蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)考察雙氫楊梅樹皮素對(duì)ALI小鼠肺部調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的功能及蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，為后續(xù)探討雙氫楊梅樹皮素調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化改善ALI/ARDS的機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

雙氫楊梅樹皮素[廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，從藤茶（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mass）W.T.Wang）的莖葉中分離、純化得到，為白色粉末狀，純度≥98%]。醋酸地塞米松（批號(hào)：2201222，安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司）；脂多糖（LPS，批號(hào)：12101031，北京索萊寶科技有限公司）；流式抗體PE-F4/80、FITC-CD11b、CD86-APC、PE-Cy7-CD206（批號(hào)分別為12-4801-82、11-0112-82、17-0862-82、25-2061-82，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；PI3K抗體、Akt抗體（批號(hào)分別為2893S、4691S，Cell Signaling Technology），β-Actin抗體（批號(hào)：00078629，Proteintech）；10%SDSPAGE凝膠配制盒（批號(hào)：02581100，上海雅酶生物科技有限公司）。BD LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠36只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2019-0001]。

1.3 數(shù)據(jù)庫

PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih. gov/），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/），Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），微生信（https：//www.bioinformatics.com.cn/login/）在線作圖平臺(tái)，GEO數(shù)據(jù)庫（https：gene expression omnibus），DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

應(yīng)用PharmMapper、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索雙氫楊梅樹皮素的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和ALI/ARDS相關(guān)疾病靶點(diǎn)，兩者取交集，上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，根據(jù)Degree≥16、Closeness Centrality≥0.524、Betweenness Centrality≥0.002篩選靶點(diǎn)并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，獲得41個(gè)潛在核心靶點(diǎn)。利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，主要通路包括PI3K-Akt、雌激素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗，并運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1。

圖1 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 “Compound-target-pathway” network

根據(jù)篩選出的6個(gè)核心靶點(diǎn)與雙氫楊梅樹皮素進(jìn)行對(duì)接。在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取“ampelopsin”的化學(xué)結(jié)構(gòu)（PubChem CID：25184515），利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算，ΔG值越小表示結(jié)合能越高，越容易與受體結(jié)合，對(duì)接結(jié)果見表1，與雙氫楊梅樹皮素對(duì)接的相互作用見圖2。其中MMP9、IGF1與雙氫楊梅樹皮素的結(jié)合能力較強(qiáng)，結(jié)合能分別為－7.77 kJ·mol－1、－7.27 kJ·mol－1。

表1 雙氫楊梅樹皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Tab 1 Molecular docking of ampelopsin with key target

圖2 蛋白與雙氫楊梅樹皮素對(duì)接的相互作用示意圖Fig 2 Interaction between protein and ampelopsin

2.2 巨噬細(xì)胞差異基因篩選及KEGG通路分析

從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得GSE95405基因芯片數(shù)據(jù)集。此數(shù)據(jù)為GPL570平臺(tái)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因芯片，選取經(jīng)干擾素-γ（INF-γ）和LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 型極化的3例樣本，白細(xì)胞介素-4（IL-4）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化的3例樣本，共獲得3980個(gè)差異基因。其中1682個(gè)基因在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；2298個(gè)基因在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。利用GEO2R分析芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因，過濾條件為P＜0.001及差異倍數(shù)|logFC|＞2。利用DAVID數(shù)據(jù)庫將篩選的差異基因?qū)?DAVID 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，按照P值排序，主要包括PI3K-Akt、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用等信號(hào)通路，選取前20條信號(hào)通路可視化，富集通路結(jié)果見圖3。

圖3 差異基因KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of differential gene

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)物分組與給藥方法 將36只SPF級(jí)KM小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組，模型組，地塞米松組（5 mg·kg－1），雙氫楊梅樹皮素高、中、低（400、200、100 mg·kg－1）劑量組，每組6只。正常對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水，其余各組小鼠氣管內(nèi)滴注8 mg·kg－1的LPS建立ALI小鼠模型，雙氫楊梅樹皮素各劑量組和地塞米松組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)3 d。

2.3.2 肺泡灌洗液的收集與巨噬細(xì)胞亞型的檢測(cè) 肺泡灌洗液用1 mL注射器向氣管內(nèi)緩慢注入0.5 mL預(yù)冷的生理鹽水灌洗小鼠肺組織，慢慢回抽灌洗液，反復(fù)灌3次，每遍沖洗3次，回收肺泡灌洗液（BALF）。BALF 4℃、1000 r·min－1離心10 min，收集細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞懸液中加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻放置15 min，期間輕輕混勻2次，紅細(xì)胞裂解后，溶液為清亮透明液體；4℃、1000 r·min－1離心10 min，小心倒去上清液，獲取細(xì)胞沉淀，PBS重懸細(xì)胞；每管加入FITC-CD11b、PEF4/80、CD86-APC和PE-Cy7-CD206抗體。冰上避光孵育30 min，孵育完成后，每支流式管加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞；4℃、1000 r·min－1離心5 min，洗去未結(jié)合或者非特異性結(jié)合的流式抗體，重復(fù)2次；加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，過濾到流式管中，得到流式抗體染色后的小鼠BALF單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。

2.3.3 雙氫楊梅樹皮素誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞向M2型極化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠BALF中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80和CD11b、M1型標(biāo)志物CD86以及M2型標(biāo)志物CD206。如圖4和表2顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組中表達(dá)F4/80＋CD11b＋CD86＋的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.001），而F4/80＋CD11b＋CD206＋的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.001）；雙氫楊梅樹皮素干預(yù)后F4/80＋CD11b＋CD206＋的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.01），且M1/M2的比例也明顯降低（P＜0.01）。由此可見，雙氫楊梅樹皮素可促進(jìn)肺巨噬細(xì)胞向M2型極化。

表2 雙氫楊梅樹皮素對(duì)小鼠BALF中巨噬細(xì)胞極化的影響(%，x±s，n＝6)Tab 2 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF(%，x ±s，n＝6)

圖4 雙氫楊梅樹皮素對(duì)小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞極化的影響Fig 4 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF

2.3.4 雙氫楊梅樹皮素降低小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白的表達(dá) 取小鼠肺組織以1∶1比例（1 g組織 ∶1 mL裂解液）使用勻漿機(jī)進(jìn)行研磨，4℃、15 000 r·min－1離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒制備10%的PAGE膠，上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉40 min后加一抗，其中內(nèi)參β-Actin為1∶5000，PI3K/Akt抗體為1∶1000，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗1∶5000，常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯影，利用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果。與正常對(duì)照組相比，模型組PI3K、Akt蛋白表達(dá)量明顯增加；與模型組相比，雙氫楊梅樹皮素高劑量組PI3K 蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），雙氫楊梅樹皮素各劑量組Akt蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖5。

圖5 雙氫楊梅樹皮素對(duì)小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)量的影響（x ±s，n＝3）Fig 5 Effect of ampelopsin on the expression level of PI3K and Akt in the lung（x ±s，n＝3）

2.4 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用軟件為SPSS 20和GraphPadPrism8.0，結(jié)果用x± s表示。組間差異使用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)AKT1、ALB等為雙氫楊梅樹皮素改善ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點(diǎn)，AKT1是肺內(nèi)皮細(xì)胞中AKT的主要亞型，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管滲漏預(yù)防具有重要作用，敲除AKT1會(huì)降低層黏連蛋白和基底膜厚度，造成血管通透性增加，從而加重肺損傷[9-10]。KEGG通路分析表明，雙氫楊梅樹皮素改善ALI/ARDS與PI3K/Akt、雌激素等信號(hào)通路相關(guān)，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等功能，通過激活μ阿片類受體（MOR）抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以改善LPS造成的ALI/ARDS[11]。黃芩苷通過降低PI3K/Akt信號(hào)通路的活化水平可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化和抑制M1型極化[12]。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[13-14]，與本研究通路分析結(jié)果一致，雌激素信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)M2型極化的重要通路之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雙氫楊梅樹皮素能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，降低肺泡內(nèi)IL-6和IL-1β等促炎細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)降低單核-巨噬細(xì)胞的比例改善ALI。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙氫楊梅樹皮素能明顯增加M2型巨噬細(xì)胞極化和降低M1/M2的比例，Western blot結(jié)果表明模型組小鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)量明顯增加，給予雙氫楊梅樹皮素干預(yù)后，各給藥組PI3K和Akt蛋白表達(dá)量顯著降低，證實(shí)雙氫楊梅樹皮素具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化改善ALI/ARDS的潛在治療作用，且作用機(jī)制可能是與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上，本研究借助多種生物信息學(xué)手段，將雙氫楊梅樹皮素進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、通路分析，聯(lián)合ALI中免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞極化差異表達(dá)基因，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1/M2型巨噬細(xì)胞及肺組織中PI3K和Akt的蛋白表達(dá)量驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。雙氫楊梅樹皮素通過降低PI3K和Akt的蛋白表達(dá)量調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化從而改善ALI。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步深入研究雙氫楊梅樹皮素調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制，以期為指導(dǎo)通過藥物調(diào)控巨噬細(xì)胞向有利于遏制疾病的方向極化，為疾病的治療提供新的方法。