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        網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合巨噬細(xì)胞差異基因揭示雙氫楊梅樹皮素改善急性肺損傷的作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

        2023-06-07 06:40:06唐木蘭曾春暉黃鑫波王溢朱海濱楊柯廣西中醫(yī)藥大學(xué)南寧530000
        中南藥學(xué) 2023年5期
        關(guān)鍵詞:雙氫樹皮楊梅

        唐木蘭,曾春暉,黃鑫波,王溢,朱海濱,楊柯(廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530000)

        急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指繼發(fā)于非心源性呼吸窘迫的低氧血癥-原發(fā)性肺水腫。ALI隨著病情進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),病死率高達(dá)30%~50%[1-2]。巨噬細(xì)胞在炎癥發(fā)生過程和免疫系統(tǒng)激活起到關(guān)鍵作用,其具有可塑性和功能多樣性,可以極化為M1或M2亞型。M1 型巨噬細(xì)胞與促炎有關(guān),而 M2型巨噬細(xì)胞則與抗炎、傷口愈合及纖維化作用相關(guān)[3-4]。已有研究證實(shí),在ALI/ARDS急性滲出期M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增加,因此巨噬細(xì)胞可被作為治療ALI/ARDS的靶細(xì)胞。

        藤茶[Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang]系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄的嫩莖葉,含有豐富的黃酮類化合物,以雙氫楊梅樹皮素為主[5]。課題組前期實(shí)驗(yàn)已證明藤茶能顯著增加小鼠胸腺、脾臟等免疫器官的重量[6-7],具有增強(qiáng)非特異性免疫功能和體液免疫功能的作用;前期研究也表明雙氫楊梅樹皮素具有抵抗博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化作用,改善呼吸功能衰退的癥狀[8]。本文構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò),提示雙氫楊梅樹皮素可通過PI3K-Akt信號(hào)通路改善ALI,且進(jìn)行巨噬細(xì)胞極化差異基因KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞的極化也與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取PI3K/Akt信號(hào)通路的主要蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)考察雙氫楊梅樹皮素對(duì)ALI小鼠肺部調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的功能及蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,為后續(xù)探討雙氫楊梅樹皮素調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化改善ALI/ARDS的機(jī)制研究提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器與試藥

        雙氫楊梅樹皮素[廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,從藤茶(Ampelopsis grossedentata(Hand-Mass)W.T.Wang)的莖葉中分離、純化得到,為白色粉末狀,純度≥98%]。醋酸地塞米松(批號(hào):2201222,安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司);脂多糖(LPS,批號(hào):12101031,北京索萊寶科技有限公司);流式抗體PE-F4/80、FITC-CD11b、CD86-APC、PE-Cy7-CD206(批號(hào)分別為12-4801-82、11-0112-82、17-0862-82、25-2061-82,美國賽默飛世爾科技公司);PI3K抗體、Akt抗體(批號(hào)分別為2893S、4691S,Cell Signaling Technology),β-Actin抗體(批號(hào):00078629,Proteintech);10%SDSPAGE凝膠配制盒(批號(hào):02581100,上海雅酶生物科技有限公司)。BD LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        SPF級(jí)KM小鼠36只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004;動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(桂)2019-0001]。

        1.3 數(shù)據(jù)庫

        PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem. ncbi.nlm.nih. gov/),GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/),Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/login/)在線作圖平臺(tái),GEO數(shù)據(jù)庫(https:gene expression omnibus),DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

        應(yīng)用PharmMapper、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索雙氫楊梅樹皮素的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和ALI/ARDS相關(guān)疾病靶點(diǎn),兩者取交集,上傳至STRING數(shù)據(jù)庫,根據(jù)Degree≥16、Closeness Centrality≥0.524、Betweenness Centrality≥0.002篩選靶點(diǎn)并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò),獲得41個(gè)潛在核心靶點(diǎn)。利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,主要通路包括PI3K-Akt、雌激素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗,并運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果見圖1。

        圖1 “化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 “Compound-target-pathway” network

        根據(jù)篩選出的6個(gè)核心靶點(diǎn)與雙氫楊梅樹皮素進(jìn)行對(duì)接。在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取“ampelopsin”的化學(xué)結(jié)構(gòu)(PubChem CID:25184515),利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算,ΔG值越小表示結(jié)合能越高,越容易與受體結(jié)合,對(duì)接結(jié)果見表1,與雙氫楊梅樹皮素對(duì)接的相互作用見圖2。其中MMP9、IGF1與雙氫楊梅樹皮素的結(jié)合能力較強(qiáng),結(jié)合能分別為-7.77 kJ·mol-1、-7.27 kJ·mol-1。

        表1 雙氫楊梅樹皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Tab 1 Molecular docking of ampelopsin with key target

        圖2 蛋白與雙氫楊梅樹皮素對(duì)接的相互作用示意圖Fig 2 Interaction between protein and ampelopsin

        2.2 巨噬細(xì)胞差異基因篩選及KEGG通路分析

        從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得GSE95405基因芯片數(shù)據(jù)集。此數(shù)據(jù)為GPL570平臺(tái)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因芯片,選取經(jīng)干擾素-γ(INF-γ)和LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 型極化的3例樣本,白細(xì)胞介素-4(IL-4)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化的3例樣本,共獲得3980個(gè)差異基因。其中1682個(gè)基因在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào);2298個(gè)基因在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。利用GEO2R分析芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因,過濾條件為P<0.001及差異倍數(shù)|logFC|>2。利用DAVID數(shù)據(jù)庫將篩選的差異基因?qū)?DAVID 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 KEGG 通路富集分析,按照P值排序,主要包括PI3K-Akt、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用等信號(hào)通路,選取前20條信號(hào)通路可視化,富集通路結(jié)果見圖3。

        圖3 差異基因KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of differential gene

        2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

        2.3.1 動(dòng)物分組與給藥方法 將36只SPF級(jí)KM小鼠隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組,模型組,地塞米松組(5 mg·kg-1),雙氫楊梅樹皮素高、中、低(400、200、100 mg·kg-1)劑量組,每組6只。正常對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水,其余各組小鼠氣管內(nèi)滴注8 mg·kg-1的LPS建立ALI小鼠模型,雙氫楊梅樹皮素各劑量組和地塞米松組灌胃相應(yīng)劑量的藥物,正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)3 d。

        2.3.2 肺泡灌洗液的收集與巨噬細(xì)胞亞型的檢測(cè) 肺泡灌洗液用1 mL注射器向氣管內(nèi)緩慢注入0.5 mL預(yù)冷的生理鹽水灌洗小鼠肺組織,慢慢回抽灌洗液,反復(fù)灌3次,每遍沖洗3次,回收肺泡灌洗液(BALF)。BALF 4℃、1000 r·min-1離心10 min,收集細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞懸液中加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液,顛倒混勻放置15 min,期間輕輕混勻2次,紅細(xì)胞裂解后,溶液為清亮透明液體;4℃、1000 r·min-1離心10 min,小心倒去上清液,獲取細(xì)胞沉淀,PBS重懸細(xì)胞;每管加入FITC-CD11b、PEF4/80、CD86-APC和PE-Cy7-CD206抗體。冰上避光孵育30 min,孵育完成后,每支流式管加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞;4℃、1000 r·min-1離心5 min,洗去未結(jié)合或者非特異性結(jié)合的流式抗體,重復(fù)2次;加入1 mL PBS重懸細(xì)胞,過濾到流式管中,得到流式抗體染色后的小鼠BALF單細(xì)胞懸液,上機(jī)檢測(cè)。

        2.3.3 雙氫楊梅樹皮素誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞向M2型極化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠BALF中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80和CD11b、M1型標(biāo)志物CD86以及M2型標(biāo)志物CD206。如圖4和表2顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組中表達(dá)F4/80+CD11b+CD86+的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.001),而F4/80+CD11b+CD206+的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.001);雙氫楊梅樹皮素干預(yù)后F4/80+CD11b+CD206+的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),且M1/M2的比例也明顯降低(P<0.01)。由此可見,雙氫楊梅樹皮素可促進(jìn)肺巨噬細(xì)胞向M2型極化。

        表2 雙氫楊梅樹皮素對(duì)小鼠BALF中巨噬細(xì)胞極化的影響(%,x±s,n=6)Tab 2 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF(%,x ±s,n=6)

        圖4 雙氫楊梅樹皮素對(duì)小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞極化的影響Fig 4 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF

        2.3.4 雙氫楊梅樹皮素降低小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白的表達(dá) 取小鼠肺組織以1∶1比例(1 g組織 ∶1 mL裂解液)使用勻漿機(jī)進(jìn)行研磨,4℃、15 000 r·min-1離心10 min,取上清液,用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒制備10%的PAGE膠,上樣,電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,快速封閉液封閉40 min后加一抗,其中內(nèi)參β-Actin為1∶5000,PI3K/Akt抗體為1∶1000,4℃過夜,TBST洗膜3次,加入二抗1∶5000,常溫孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL發(fā)光液顯影,利用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果。與正常對(duì)照組相比,模型組PI3K、Akt蛋白表達(dá)量明顯增加;與模型組相比,雙氫楊梅樹皮素高劑量組PI3K 蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05),雙氫楊梅樹皮素各劑量組Akt蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05),結(jié)果見圖5。

        圖5 雙氫楊梅樹皮素對(duì)小鼠肺組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)量的影響(x ±s,n=3)Fig 5 Effect of ampelopsin on the expression level of PI3K and Akt in the lung(x ±s,n=3)

        2.4 數(shù)據(jù)處理

        本研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用軟件為SPSS 20和GraphPadPrism8.0,結(jié)果用x± s表示。組間差異使用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 討論

        本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)AKT1、ALB等為雙氫楊梅樹皮素改善ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點(diǎn),AKT1是肺內(nèi)皮細(xì)胞中AKT的主要亞型,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管滲漏預(yù)防具有重要作用,敲除AKT1會(huì)降低層黏連蛋白和基底膜厚度,造成血管通透性增加,從而加重肺損傷[9-10]。KEGG通路分析表明,雙氫楊梅樹皮素改善ALI/ARDS與PI3K/Akt、雌激素等信號(hào)通路相關(guān),其中PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等功能,通過激活μ阿片類受體(MOR)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以改善LPS造成的ALI/ARDS[11]。黃芩苷通過降低PI3K/Akt信號(hào)通路的活化水平可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化和抑制M1型極化[12]。另外,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),雌激素能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[13-14],與本研究通路分析結(jié)果一致,雌激素信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)M2型極化的重要通路之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),雙氫楊梅樹皮素能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路,降低肺泡內(nèi)IL-6和IL-1β等促炎細(xì)胞因子的釋放,同時(shí)降低單核-巨噬細(xì)胞的比例改善ALI。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,雙氫楊梅樹皮素能明顯增加M2型巨噬細(xì)胞極化和降低M1/M2的比例,Western blot結(jié)果表明模型組小鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)量明顯增加,給予雙氫楊梅樹皮素干預(yù)后,各給藥組PI3K和Akt蛋白表達(dá)量顯著降低,證實(shí)雙氫楊梅樹皮素具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化改善ALI/ARDS的潛在治療作用,且作用機(jī)制可能是與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

        綜上,本研究借助多種生物信息學(xué)手段,將雙氫楊梅樹皮素進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、通路分析,聯(lián)合ALI中免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞極化差異表達(dá)基因,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1/M2型巨噬細(xì)胞及肺組織中PI3K和Akt的蛋白表達(dá)量驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。雙氫楊梅樹皮素通過降低PI3K和Akt的蛋白表達(dá)量調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化從而改善ALI。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步深入研究雙氫楊梅樹皮素調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制,以期為指導(dǎo)通過藥物調(diào)控巨噬細(xì)胞向有利于遏制疾病的方向極化,為疾病的治療提供新的方法。

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