陳博，劉一帥，田葳，葉田田，楊瑞，王淑君*（1. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 001；. 沈陽藥科大學，沈陽 110016；. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，沈陽 11004；4. 江蘇艾迪納米生物醫(yī)藥有限公司，江蘇 南通61；. 南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 61）

肺是人體的重要器官，空氣中的灰塵顆粒、有毒物質和細菌等吸入肺部都有可能引起肺部疾病以及全身疾病[1]。肺部疾病包括各種肺炎（細菌、真菌、病毒性或吸入性肺炎）、肺纖維化、肺癌和哮喘等。靶向藥物遞送到肺部已成為全身或局部藥物遞送系統(tǒng)的重要研究方向之一。莪術醇（curcumol，Cur）又名姜黃醇，主要來自于姜科植物莪術、姜黃等中藥中提取分離的一種倍半萜類化學成分，為無色針狀結晶，易溶于乙醚、氯仿，溶于乙醇，微溶于石油醚，幾乎不溶于水，在水中的溶解度僅為0.3%[2]。莪術醇是莪術揮發(fā)油的重要成分之一，具有抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理作用，在臨床治療中具有廣闊的應用前景[3-4]?，F(xiàn)代藥理學證實，莪術醇可使致纖維化因子α-SMA、Smad2/3、TGF-β的mRNA表達水平降低[5]。莪術醇可以降低肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1的表達，降低肺組織中羥脯氨酸的含量，緩解博來霉素誘導的大鼠肺纖維化[6]。莪術醇可以通過抑制JAK1/STAT3信號通路激活而抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[7]。張國立等[8]通過將莪術揮發(fā)油和莪術醇制備成肺吸入給藥的粉霧劑，將藥物遞送至肺部，不僅對急性肺損傷具有良好的治療作用，而且提高了藥物的肺組織分布，減少了全身其他組織分布及不良反應。

由于莪術醇幾乎不溶于水，很難達到口服或注射給藥的要求，極大地限制了其實驗研究和臨床應用。脂質體（liposome，LP）主要是由兩親性的磷脂和其他輔料構建的雙層囊泡，具有類細胞結構，可以作為藥物的有效載體。利用脂質體包裹莪術醇可提高其溶解度，增強穩(wěn)定性，同時具有低毒性、緩釋、改善穩(wěn)定性等優(yōu)點[9]。其中，柔性脂質體又稱為可變形脂質體，由于其高變性、高柔韌性、高滲透性的特點被廣泛應用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中，但是在霧化吸入給藥方面報道較少[10]。相比較于靜脈注射，霧化吸入由于使用方便、肺組織濃度較高、全身不良反應少等特點而日益受到重視[11]。本實驗采用薄膜水化法制備了莪術醇柔性脂質體，優(yōu)化了其處方和工藝，并對該制劑的質量以及體外活性進行了評價，通過霧化吸入的給藥方式考察了莪術醇柔性脂質體的肺部靶向性，以期提高莪術醇柔性脂質體的肺部靶向性和肺部疾病的治療效果，為莪術醇新劑型的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞和動物

A549人肺腺癌細胞（武漢尚恩生物技術有限公司，批號：SNL-089），SPF級KM雄性小鼠12只[遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001]，在沈陽藥科大學動物實驗中心[許可證編號：SYXK（遼）2021-0009]進行實驗，操作嚴格遵守實驗動物倫理保護等相關規(guī)定。

1.2 試藥

莪術醇（自制[12]，純度＞97%，批號：20220401），莪術醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥99.9%，批號：100185-201908），磷鎢酸負染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20201130），大豆卵磷脂S100（德國利寶益公司，批號：903910B），吲哚菁綠（批號：C14185060），葡聚糖凝膠G50（批號：C14185058），膽固醇（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C12398354），TGF-β1[派普泰克生物科技（蘇州）有限公司，批號：0719354]，磷酸鹽緩沖液（含5%海藻糖，pH 7.2，聯(lián)科生物，批號：A20635），RPMI-1640培養(yǎng)基、1×磷酸鹽緩沖液（Gibco公司），胎牛血清（HyClone公司），無水乙醇、二氯甲烷為國產(chǎn)分析純，甲醇為國產(chǎn)色譜純。

1.3 儀器

2 方法與結果

2.1 莪術醇柔性脂質體含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為DB-WAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣口溫度為240℃；檢測器溫度為250℃；柱流量為1.5 mL·min－1；進樣方式為液體直接進樣；分流比為5∶1；升溫程序為起始溫度185℃，保持10 min，以20℃·min－1升溫至225℃，保持8 min。

2.1.2 專屬性實驗 ① 空白溶劑為甲醇；② 取空白脂質體0.2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得空白脂質體溶液；③ 精密稱取莪術醇對照品20 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2 mg·mL－1的莪術醇對照品儲備液，精密移取莪術醇對照品儲備液0.2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，即得0.04 mg·mL－1的莪術醇對照品溶液；④ 精密稱取莪術醇供試品20 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2 mg·mL－1的莪術醇供試品儲備液，同莪術醇對照品儲備液處理，即得0.04 mg·mL－1的莪術醇供試品溶液。取空白溶劑、空白脂質體、供試品溶液及對照品溶液各2 μL，分別進樣分析，結果如圖1所示，莪術醇對照品及供試品在該色譜條件下的保留時間分別為8.919、8.921 min，空白溶劑、空白輔料溶液均不干擾莪術醇測定，專屬性良好。

圖1 專屬性色譜圖Fig 1 Specificity chromatogram

2.1.3 線性關系考察 精密量取莪術醇儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，照“2.1.1”項下色譜條件，進樣測定，以莪術醇的質量濃度（C，mg·mL－1）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程為：A＝4.769×106C＋1.382×103，r為0.9992。結果表明，莪術醇在0.020～0.120 mg·mL－1與峰面積線性關系良好。

2.1.4 儀器精密度考察 取莪術醇柔性脂質體對照品溶液連續(xù)進樣6次。取供試品溶液連續(xù)進樣6次，結果莪術醇的保留時間RSD值為0.02%，峰面積RSD值為0.48%，儀器精密度符合規(guī)定。

2.1.5 重復性考察 按照“2.1.2”項下方法配制供試品溶液，平行6份，進樣分析，結果莪術醇含量的RSD值為0.52%，表明方法重復性良好。

2.1.6 溶液穩(wěn)定性考察 按照“2.1.2”項下方法配制溶液，對照品溶液和供試品溶液分別于0、2、4、8、10、12 h進樣測定，記錄色譜圖，考察放置穩(wěn)定性。結果對照品溶液、供試品溶液峰面積RSD值分別為0.61%、0.59%，說明供試品溶液、對照品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收實驗 按照“2.1.2”項下方法配制溶液，精密稱取莪術醇對照品溶液，分別配制成低、中、高（0.02、0.04、0.06 mg·mL－1）3個質量濃度，加入等量莪術醇柔性脂質體，平行配制3份；測得低、中、高濃度的平均加樣回收率分別為99.05%、101.89%、102.05%，其RSD分別為0.71%、0.20%、0.15%，結果表明加樣回收率良好。

準確稱取樣品10.0 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋10 min，加入3～4 g NaCl（140 ℃，烘烤4 h），渦旋1 min，在5000 r/min下離心5 min；取上清液1.5 mL，加入30 mg PSA和50 mg無水硫酸鎂，振蕩1 min，10000 r/min下離心5 min；取上清液過0.22 μm有機濾膜，待測。

2.1.8 包封率的測定 采用微柱離心法[13]測定脂質體包封率，取制備好的微型凝膠柱，精密吸取0.2 mL脂質體溶液，加于微型凝膠柱的頂端，3000 r·min－1離心3 min，繼續(xù)加入0.2 mL純化水于凝膠柱的頂端，3000 r·min－1離心3 min，用相同體積的純化水分別連續(xù)洗脫，重復上述操作4次，合并洗脫液，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，取2 μL進樣分析，得峰面積A樣，平行測定3份；另分別精密吸取0.2 mL脂質體溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，取2 μL進樣分析，得峰面積A對，平行測定3份。包封率（%）＝A樣/A對×100%。

2.2 莪術醇柔性脂質體制備方法篩選

2.2.1 薄膜水化法[14]分別精密稱取處方量莪術醇、大豆卵磷脂S100和膽固醇于茄形瓶中，加入5 mL無水乙醇，超聲至固體全部溶解，得到淡黃色澄清透明溶液，待脂質膜材料溶解后。將茄形瓶于40℃下真空旋轉蒸發(fā)30 min，除去乙醇，得干燥的脂質沉積物。量取10 mL純化水，于40℃下預熱，預熱完全后加入茄形瓶中，水化30 min。將水化后脂質體混懸液置于EP管在冰浴中，于400 W探頭超聲15 min（工作3 s，間歇3 s），隨后過1次0.8 μm微孔濾膜，過2次0.22 μm微孔濾膜，即得，測定脂質體包封率及粒徑。

2.2.2 逆向蒸發(fā)法[15]分別精密稱取處方量莪術醇、大豆卵磷脂S100和膽固醇于EP管，加入6 mL二氯甲烷，超聲至固體全部溶解。用注射器將2 mL純化水抽出，將針頭完全插在有機相液面下方，緩緩打入其中，在冰浴中于400 W探頭超聲5 min（工作3 s，間歇3 s），成白色乳濁液，靜置10 min穩(wěn)定無明顯分層。45℃減壓旋蒸除去有機溶劑約30 min，成凝膠狀。取10 mL純化水40℃下預熱，預熱完全后加入茄形瓶中，水化30 min。將水化后脂質體混懸液于EP管在冰浴中400 W探頭超聲10 min（工作3 s，間歇3 s），隨后過1次0.8 μm微孔濾膜，過2次0.22 μm微孔濾膜，即得，測定脂質體包封率及粒徑。

2.2.3 乙醇注入法[16]分別精密稱取處方量莪術醇、大豆卵磷脂S100和膽固醇，加入5 mL無水乙醇，超聲至固體全部溶解。將有機相通過注射器緩緩注入處方量純化水中。于45℃水浴磁力攪拌至無醇味后將脂質體混懸液置于EP管，在冰浴中于400 W探頭超聲15 min（工作3 s，間歇3 s），隨后過1次0.8 μm微孔濾膜，過2次0.22 μm微孔濾膜，即得，測定脂質體包封率及粒徑。

2.2.4 確定制備方法 根據(jù)包封率選擇合適的脂質體制備方法，測定其包封率、中值粒徑（D50）、跨度（Span），結果見表1。薄膜水化法制得脂質體包封率最高。薄膜水化法可能由于在旋蒸過程中，在茄形瓶內壁上形成一層脂質薄膜，使莪術醇與磷脂有序且均勻地排列在薄膜上，經(jīng)水化后得到包封率較高、均勻、穩(wěn)定的脂質體混懸液。因此，最終選用薄膜水化法制備莪術醇柔性脂質體。

表1 不同方法制備的脂質體包封率、粒徑Tab 1 Encapsulation rate and particle size of liposomes prepared by different methods

2.3 莪術醇柔性脂質體處方的單因素考察

根據(jù)脂質體常用的輔料及種類，以包封率為重點考察指標，參照表2條件對輔料的種類及用量進行篩選，對脂質體的制備工藝進行優(yōu)化。結果表明，當藥脂比為1∶30（w/w）時，包封率達到最大值，當磷脂用量過大時包封率反而會下降，穩(wěn)定性降低；當無膽固醇時包封率高、Span值小，粒徑分布均勻，最終選擇無膽固醇為進一步的優(yōu)化條件；成膜溫度在50℃時脂質體的包封率較高；水化溫度在40℃時包封率最高，再結合磷脂的相變溫度，考慮制劑穩(wěn)定性，最終選擇水化溫度40℃為進一步的優(yōu)化條件；水化15 min時包封率最高，且可水化完全，最終選擇水化時間15 min為進一步的優(yōu)化條件；水化轉速為1204～1212 r·min－1時包封率最高，且可水化完全，最終選擇水化轉速為1204～1212 r·min－1為進一步的優(yōu)化條件。

表2 單因素考察(n＝3)Tab 2 Single factor examination (n＝3)

2.4 正交設計優(yōu)化莪術醇柔性脂質體處方

在單因素考察結果的基礎上，選擇藥脂比（A）、膜材比（B）、旋蒸溫度（C）3個影響因素，每個因素3個水平，以包封率為主要考察指標，進行三因素三水平的正交實驗，實驗設計見表3。選用L9（33）正交表，分別制得莪術醇柔性脂質體，測定其包封率，結果見表4，方差分析見表5。

表3 正交實驗因素水平Tab 3 Factor and level

表4 正交實驗結果Tab 4 Orthogonal test

表5 方差分析Tab 5 Analysis of variance

重要程度依次為藥脂比（A）＞膜材比（B）＞旋蒸溫度（C），最終確定最佳處方為A2B2C2，即藥脂比為1∶30，不加膽固醇，旋蒸溫度為50℃。

2.5 驗證實驗

按最優(yōu)處方制備3批莪術醇柔性脂質體，測定其包封率和粒徑，結果見表6，脂質體的平均包封率為83.92%，平均粒徑為0.116 μm。

表6 3批脂質體的包封率和粒徑Tab 6 Encapsulation rate and particle size of the 3 batches of liposomes

2.6 透射電子顯微鏡觀察

取稀釋后的莪術醇柔性脂質體10 μL滴在銅網(wǎng)上，靜置10 min后用毛邊濾紙吸去多余的水分，向銅網(wǎng)表面滴加2%磷鎢酸溶液，負染3 min，烘干后將樣品放置在透射電鏡下觀察并拍攝電鏡照片，可觀察到脂質體外觀呈圓整球形，粒徑在100～200 nm，如圖2所示。

圖2 莪術醇柔性脂質體的透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron micrograph of curcumol liposomes

2.7 體外釋放的測定

精密量取莪術醇柔性脂質體以及莪術醇溶液2 mL，加入透析袋中，兩端夾緊后置于含40%乙醇（V/V）的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，30 mL）中，每個樣品平行3份，避光，37℃恒溫振蕩。分別于1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h吸取2 mL透析液，并補加等體積磷酸鹽緩沖液[17-18]。按“2.1.1”項下色譜條件測定其含量，并計算藥物的累積釋放百分率，結果如圖3所示。

圖3 莪術醇柔性脂質體的體外釋放曲線Fig 3 In vitro release curves of curcumol liposomes

2.8 莪術醇柔性脂質體對細胞增殖的影響

目前，對于細胞增殖監(jiān)測的方法采用的是傳統(tǒng)的終點法，即僅僅給出某個時間點的結果，而在監(jiān)測的時候需要破壞細胞，這種方法無法獲得細胞真正的生長狀態(tài)，對細胞的生長過程無法做出動態(tài)檢測和分析。為了更好地觀察和統(tǒng)計莪術醇對A549細胞的影響，本實驗采用了能夠非傷害的、長時間實時動態(tài)觀察活細胞的功能分析系統(tǒng)（IncuCyte）來監(jiān)測細胞增殖情況。

2.8.1 莪術醇對細胞增殖的影響 將復蘇的A549細胞接種到F-12培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。傳代2～3次，取處于對數(shù)生長期的A549細胞制備成單細胞懸液，以5000個/孔的細胞密度接種于96孔板中。待細胞貼壁后，每孔再加入10 μL質量濃度為10 ng·mL－1的TGF-β1進行造模。再將96孔板置于IncuCyte中，對每孔持續(xù)拍照24 h。觀察各組細胞形態(tài)，如圖4所示，對照組A549細胞呈鵝卵石樣，細胞大小均勻，沒有突觸、多角，貼壁狀態(tài)良好。經(jīng)TGF-β1刺激后，A549細胞呈現(xiàn)梭狀，細胞圓形度明顯降低，與成纖維細胞相似，說明造模成功。棄去板中液體，再加入不同質量濃度的莪術醇（80、53、35、23、15、10、7、4、3 μg·mL－1）至96孔板中，以0.1% DMSO作為對照組處理細胞，每組5個復孔。將96孔板放入IncuCyte中，每孔持續(xù)拍照48 h，結果莪術醇呈濃度依賴性抑制細胞增殖（見圖5），選取合適濃度的莪術醇進行后續(xù)實驗。

圖4 A549細胞（A）和TGF-β1誘導的A549細胞（B）Fig 4 A549 cells（A）and TGF-β1-induced A549 cells（B）

圖5 不同濃度莪術醇對TGF-β1誘導的A549細胞活性的影響Fig 5 Effect of different concentrations of curcumol on the viability of TGF-β1-induced A549 cells

2.8.2 莪術醇柔性脂質體對細胞增殖的影響 將空白脂質體、莪術醇、莪術醇柔性脂質體加至96孔板中（設置空白組、對照組），每組5個復孔，測定藥物對細胞動態(tài)生長趨勢的影響，用Confluence（%）表示細胞增殖的匯合度。將板放入IncuCyte中，96孔板每孔持續(xù)拍照48 h，結果如圖6所示，空白脂質體48 h時在實驗濃度范圍內細胞的存活率大于90%，表明空白脂質體無明顯毒性作用。莪術醇組和莪術醇柔性脂質體組對TGF-β1誘導的A549細胞均具有濃度和時間依賴性的抑制作用，且莪術醇柔性脂質體組效果優(yōu)于莪術醇組。在48 h時，莪術醇柔性脂質體的半數(shù)抑制濃度（IC50）為9.11 μg·mL－1，優(yōu)于游離莪術醇的12.23 μg·mL－1。

圖6 莪術醇與莪術醇柔性脂質體對TGF-β1誘導的A549細胞活性的影響Fig 6 Effect of curcumol and curcumol liposomes on the viability of TGF-β1-induced A549 cells

2.9 體內實驗

本研究通過包裹吲哚菁綠光敏劑進行動物活體成像，將12只健康KM小鼠（提前剃去腹部鼠毛）隨機分為空白對照組、霧化吸入莪術醇溶液組、霧化吸入莪術醇柔性脂質體組、靜脈注射莪術醇柔性脂質體組，每組3只。霧化吸入藥物質量濃度為1 mg·mL－1的莪術醇溶液和莪術醇柔性脂質體5 min，靜脈注射莪術醇柔性脂質體（5 mg·kg－1單次給藥）。在給藥后0 min、5 min、30 min、1 h、3 h、6 h、8 h、12 h、24 h分別測定小鼠體內熒光強弱。結果如圖7所示，莪術醇柔性脂質體組霧化吸入肺部滯留時間及滯留量優(yōu)于霧化吸入莪術醇溶液組和靜脈注射莪術醇柔性脂質體組。24 h后脫頸處死小鼠，取出主要器官（包括心、肝、脾、肺、腎），生理鹽水沖洗后置于血管成像儀中觀察各組織熒光情況并拍照。結果如圖8所示，霧化吸入莪術醇柔性脂質體組只分布于肺部，霧化吸入莪術醇溶液在肝部及肺部均有分布，靜脈注射莪術醇柔性脂質體主要分布于肝組織。

圖7 莪術醇在小鼠體內的分布Fig 7 In vivo distribution of curcumol in mice

圖8 莪術醇在小鼠組織的分布Fig 8 Tissue distribution of curcumol in mice

3 討論

莪術醇為脂溶性藥物，難溶于水，屬于倍半萜類化合物，且分子中具有共軛雙鍵，因此化學性質比較活潑，使其臨床應用具有一定的困難。本研究通過將莪術醇包封于脂質體中，不僅改善了其脂溶性問題，而且提高了其穩(wěn)定性。

本研究采用薄膜水化法制備了莪術醇柔性脂質體，薄膜水化法是一種經(jīng)典的制備方法，可以制備得到多室脂質體，經(jīng)過超聲處理得到小單室脂質體。該法所制的莪術醇柔性脂質體粒徑分布均勻，方法簡單，工藝可行。通過單因素考察和正交實驗確定了莪術醇的最優(yōu)處方和制備工藝。體外釋放實驗表明，莪術醇柔性脂質體相比較游離莪術醇具有更好的緩釋作用。細胞增殖實驗中，莪術醇柔性脂質體的抑制作用優(yōu)于游離的莪術醇，推測其可能與脂質體提高莪術醇的溶解度和增加莪術醇在細胞內的滯留時間相關。通過霧化吸入的給藥方式可以極大地提高莪術醇柔性脂質體的肺部靶向性，使得藥物能夠更好地到達疾病部位，減少在其他器官中的蓄積，提高藥物的有效性。

綜上所述，本研究制備的霧化吸入莪術醇柔性脂質體安全可靠，經(jīng)霧化吸入后在肺部緩慢釋放，起到緩釋作用，且在具有肺部靶向功能的同時減少了在其他健康組織的蓄積，可減輕不良反應，增加治療效果。而本實驗僅在細胞水平初步驗證了莪術醇抗纖維化活性及其在體內的肺部靶向性，未進行莪術醇柔性脂質體的抗肺纖維化藥效學實驗，后續(xù)本課題組將繼續(xù)考察莪術醇柔性脂質體的體內外藥效學實驗和體內藥代動力學等，為進一步研究莪術醇柔性脂質體抗纖維化活性奠定基礎。