王艷秋，張 玉，章 穎，邵建國(guó)**

（1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 226001；2 南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院/南通市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科）

慢性乙型病毒性肝炎（慢乙肝）由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染引起,HBV 系非侵襲性嗜肝病毒,不直接損害肝臟,而是由其抗原系統(tǒng)及其抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[1],HBV 感染后常引起白細(xì)胞聚集,巨噬細(xì)胞功能激活或嗜酸性粒細(xì)胞活化[2]。慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）是在慢性肝臟疾病基礎(chǔ)上發(fā)生的急性肝衰竭,由多種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞大量死亡,產(chǎn)生高膽紅素血癥、凝血功能障礙、嚴(yán)重感染、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至伴有肝外多發(fā)性臟器衰竭[3-4],病情發(fā)展迅速,預(yù)后差,短期死亡率高。ACLF 發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明,主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、代謝失衡等多重復(fù)雜的病理改變[5]。由于乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）的發(fā)病與免疫紊亂有密切關(guān)系,尋找免疫應(yīng)答相關(guān)因子對(duì)診斷乙肝及乙肝慢加急性肝衰竭具有重要的臨床價(jià)值。CD30 在正常人外周血中并不表達(dá),多在病毒感染的淋巴細(xì)胞、淋巴系統(tǒng)腫瘤[6]及活化T 淋巴細(xì)胞[7]中表達(dá),其胞外部分被蛋白酶切斷后在外周血中可檢測(cè)到可溶性CD30（solute CD30,sCD30）[8-9]。本研究選擇2021 年7月—11 月在南通市第三人民醫(yī)院治療的HBV-ACLF 患者92 例,檢測(cè)外周血中sCD30 表達(dá)水平及其診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HBV-ACLF 患者92 例作為HBVACLF 組,選擇我院同期慢乙肝患者90 例作為慢乙肝組,健康體檢者90 例作為對(duì)照組。HBV-ACLF 組患者符合肝衰竭診治指南（2018 年版）有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),慢乙肝組患者符合慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),均排除其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病和原發(fā)性肝癌,3 個(gè)月內(nèi)未使用免疫抑制劑及激素治療。對(duì)照組人員肝功能指標(biāo)正常,乙肝抗原陰性,排除合并感染、免疫性疾病、腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病。3 組研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。3 組年齡、血小板、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、血清鈉、白蛋白、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素氮比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）,而性別構(gòu)成、白細(xì)胞、血肌酐水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HBV-ACLF 組凝血酶原時(shí)間、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值大于慢乙肝組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 各組患者一般資料及血生化指標(biāo)比較 ［±s，n，M（P25，P75）］

表1 各組患者一般資料及血生化指標(biāo)比較 ［±s，n，M（P25，P75）］

注:WBC:白細(xì)胞計(jì)數(shù);PLT:血小板計(jì)數(shù);N:中性粒細(xì)胞絕對(duì)值;L:淋巴細(xì)胞絕對(duì)值;ALT:谷丙轉(zhuǎn)氨酶;AST:谷草轉(zhuǎn)氨酶;TBI:總膽紅素;ALB:白蛋白;GGT:谷氨酰轉(zhuǎn)移酶;BUN:尿素氮;Cr:肌酐;PT:凝血酶原時(shí)間;INR:國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值。

指標(biāo)對(duì)照組（n=90）慢乙肝組（n=90）HBV-ACLF 組（n=92）統(tǒng)計(jì)值P 值年齡（歲）50.1±28.440.4±27.054.6±13.329.301＜0.001性別（男/女）54/3651/3960/322.0020.139 WBC（×109/L）6.0±1.57.1±2.16.5±3.50.9570.386 PLT（×109/L）244.4±50.3205.8±67.5109.1±64.365.285＜0.001 N（×109/L）3.2±1.24.9±1.84.4±2.915.649＜0.001 L（×109/L）2.3±0.52.7±0.91.3±0.860.443＜0.001 Na+（mmol/L）145.6±4.8142.9±5.5136.3±4.254.845＜0.001 ALT（U/L）12.5（10.0,18.5）29.0（19.0,38.25）79.0（28.0,274.0）9.278＜0.001 AST（U/L）18.0（16.0,21.0）27.0（23.0,34.8）93.0（53.5,252.5）9.665＜0.001 TBI（μmol/L）15.2（12.3,17.9）16.6（13.0,21.2）187.4（60.9,305.1）39.378＜0.001 ALB（g/L）41.2±3.243.1±4.432.6±4.865.285＜0.001 GGT（U/L）24.5（9.3,33.8）25.5（17.8,36.3）83（44.3,157.8）28.850＜0.001 BUN（mmol/L）4.4±1.26.5±5.06.4±6.15.9380.002 Cr（μmol/L）59.5（54.5,64.8）72.0（66.3,81.5）65.0（59.0,76.0）0.8930.412 PT（s）-11.8±1.117.1±5.88.520＜0.001 INR-1.1±0.21.5±0.57.114＜0.001

1.2 sCD30 檢測(cè) 用肝素抗凝管采集3 組對(duì)象清晨空腹靜脈血4 mL,1 000 r/min 離心10 min,分離血漿,分裝后放入-20 ℃冰箱備用。采用sCD30-ELISA 試劑盒（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司）,將sCD30標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照試劑盒要求進(jìn)行加樣、孵育、顯色,采用DNM-9602 型酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度。試劑盒最低可檢測(cè)濃度為0.1 ng/mL,板內(nèi)外變異系數(shù)不超過(guò)10%和15%。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 比較3 組sCD30 水平,計(jì)算sCD30檢測(cè)及其聯(lián)合HBV-DNA 檢測(cè)診斷慢乙肝及HBVACLF 的敏感度和特異度。根據(jù)中國(guó)CLIF-ACLF 標(biāo)準(zhǔn),ACLF 嚴(yán)重程度按器官衰竭數(shù)量分為3 級(jí),出現(xiàn)1 個(gè)器官衰竭為ACLF-1 級(jí),2 個(gè)器官衰竭為ACLF-2 級(jí),3 個(gè)或以上器官衰竭為ACLF-3 級(jí)。92 例HBV-ACLF 患者中ACLF-1 級(jí)48 例,2 級(jí)26 例,3級(jí)18 例,比較不同分級(jí)患者的臨床特點(diǎn)。

終末期肝病模型評(píng)分（model for end-stage liver disease score,MELD）=3.78×ln[膽紅素（mg/dL）]+11.2×ln（INR）+9.57×ln[血肌酐（mg/dL）]+6.43×病因（膽汁性或酒精性肝病為0,其他為1）;終末期肝病模型聯(lián)合血清鈉評(píng)分（MELD-Na）=MELD+1.59×（135-Na+）;CLIF-序貫器官衰竭評(píng)分（chronic liver failure -sequential organ failure as sessment score,CLIF-SOFA）:（1）CLIF-C ACLF（CLIF consortium acute on chronic liver failure score）評(píng)分=10×[0.33×CLIF-OFs+0.04×年齡+0.63×ln（白細(xì)胞數(shù)-2）];（2）CLIF-多器官衰竭評(píng)分（CLIF-organ failure score system,CLIF-OFs）標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 CLIF-OFs 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

中國(guó)重型乙型肝炎研究組制定乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭預(yù)后評(píng)分（COSSH-ACLFs）,COSSH-ACLFs=0.741×INR+0.523×HBV-SOFA+0.026×年齡+0.003×TBIL（mg/dL）,其中HBV-SOFA 評(píng)分不包含INR 及TBIL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);正態(tài)分布計(jì)量資料以±s 表示,多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn),兩組間比較采用t 檢驗(yàn);偏態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25,P75）表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件繪制sCD30表達(dá)水平ROC 曲線,采用Logistic 回歸分析sCD30和HBV-DNA 水平對(duì)HBV-ACLF 的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 3 組sCD30 水平比較 對(duì)照組、慢乙肝組、HBVACLF 組的sCD30 表達(dá)水平分別為18.6±10.2 ng/mL、20.6±10.8 ng/mL、52.4±35.1 ng/mL,3 組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。ACLF 組sCD30 水平高于對(duì)照組（P=0.000）和慢乙肝組（P=0.002）,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組與慢乙肝組sCD30 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.484）。見(jiàn)圖1A。HBV-ACLF 不同分級(jí)患者sCD30 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,見(jiàn)圖1B。

圖1 3 組sCD30 水平

2.2 sCD30 診斷價(jià)值 sCD30 診斷慢乙肝的曲線下面積（AUC）為0.5578,敏感度為57%,特異度為71%;診斷HBV-ACLF 患者的AUC 為0.7701,敏感度為83%,特異度為67%。見(jiàn)圖2。

圖2 sCD30 水平診斷慢乙肝、HBV-ACLF 的ROC 曲線

2.3 sCD30 聯(lián)合HBV-DNA 診斷HBV-ACLF 的價(jià)值 二元Logistic 回歸分析顯示,sCD30 聯(lián)合HBVDNA 檢測(cè)診斷HBV-ACLF 的AUC 為0.7860,敏感度為63%,特異度為87%。見(jiàn)圖3。

圖3 sCD30 聯(lián)合HBV-DNA 診斷慢乙肝和HBV-ACLF 的ROC 曲線

2.4 HBV-ACLF 不同分級(jí)患者臨床特點(diǎn)比較 HBVACLF 不同分級(jí)3 組年齡、WBC、PLT、ALT、AST、ALB、TBI、GGT、Cr、血清Na、INR、PT、AFP、異常凝血酶原、HBV-DNA 定量等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 HBV-ACLF 不同分級(jí)患者臨床特點(diǎn)比較 ［M（P25，P75），±s］

表3 HBV-ACLF 不同分級(jí)患者臨床特點(diǎn)比較 ［M（P25，P75），±s］

注:NLR:中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值;PWR:血小板/白細(xì)胞比值;AFP:甲胎蛋白;CLIF-C OFs:慢性肝衰竭-序貫器官衰竭評(píng)估模型簡(jiǎn)化評(píng)分;CLIF-C ACLFs:嚴(yán)重程度分級(jí);MELD:終末期肝病模型評(píng)分;MELD-Na:終末期肝病模型聯(lián)合血清鈉評(píng)分;COSSHACLFs:乙肝相關(guān)的慢加急性肝衰竭預(yù)后評(píng)分。*P＜0.05;**P＜0.01。

指標(biāo)ACLF-1 級(jí)（n=48）ACLF-2 級(jí)（n=26）ACLF-3 級(jí)（n=18）統(tǒng)計(jì)值年齡（歲）53（25,78）29（22,65）34（13,62）7.377*性別（男/女）33/1516/1011/7—WBC（×109/L）5.77（4.16,7.36）4.85（3.35,6.39）7.95（6.22,9.63）11.166**PLT（×109/L）123.50（95.00,173.00）71.00（38.00,94.50）80.00（47.00,106.5）27.664**ALT（U/L）103.50（38.75,334.00）39.00（25.50,85.50）134.00（27.00,792.00）4.982 AST（U/L）95.50（50.00,195.75）73.00（55.50,114.50）131.00（58.50,786.00）2.064 ALB（g/dL））33.35（31.40,38.13）31.00（29.45,33.55）30.00（27.35,31.20）21.990**TBI（μmol/L）93.90（28.03,241.63）266.70（119.60,342.75）305.10（175.30,467.40）19.450**GGT（U/L）121.00（55.50,177.00）65.00（37.00,135.00）54.00（42.50,138.50））4.697 Cr（μmol/L）64.50（59.00,76.00）63.00（53.50,67.20）81.00（70.00,124.00）12.919**Na+（mmol/L）138.05（134.45,139.70）135.70（132.90,137.30）134.4（132.35,137.30）12.143**NLR2.02（1.24,4.40）4.03（2.74,5.77）6.14（5.46,11.33）18.998**PWR21.79（16.33,31.82）12.05（7.02,20.12）8.72（6.91,14.60）28.118**INR1.12（0.93,1.31）1.72（1.63,2.03）1.64（1.55,2.43）60.353**PT（s）12.65（10.80,14.95）18.90（18.25,23.40）19.20（17.10,26.30）58.461**AFP（μg/L）5.62（3.10,9.85）5.67（2.93,9.40）6.47（3.57,45.65）0.494異常凝血酶原（mAU/mL）32.47（24.40,39.75）45.36（16.69,197.25）33.35（18.51,312.07）0.543 HBV-DNA（IU/mL）1.08×105（864.50,7.24×105） 5.16×105（3.02×103,6.42×108） 1.25×105（131.00,1.47×108） 1.110 CLIF-C OFs（分）6.91±0.808.33±1.0611.94±1.7335.406**CLIF-C ACLFs（分）54.93±7.858.06±8.0476.62±8.4313.693**MELD（分）26.10±6.7533.62±4.6039.61±5.7323.127**MELD-Na（分）22.01±11.3433.95±8.0739.81±8.5416.020**COSSH-ACLFs（分）5.94±0.747.12±0.859.45±1.2113.693**

3 討論

HBV-ACLF 是肝臟和伴隨肝外器官系統(tǒng)衰竭的臨床綜合征,患者存活率極低,除了肝臟移植外,現(xiàn)無(wú)其他有效的治療措施。多項(xiàng)臨床研究表明,ACLF 可能由于氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)異?；钴S,導(dǎo)致大量肝細(xì)胞壞死,產(chǎn)生嚴(yán)重高膽紅素血癥、代謝紊亂及凝血功能障礙,最終引起多器官衰竭[10-12]。

CD30 為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor,TNFR）超家族成員之一,通過(guò)與細(xì)胞膜表面CD30 配體（CD30L）結(jié)合后,再與CD30+T 細(xì)胞受體復(fù)合體發(fā)生偶聯(lián),促進(jìn)輔助型T 細(xì)胞2（Th2）的分化和增殖[13-14]。文獻(xiàn)報(bào)道1 例肝功能正常的乙肝小三陽(yáng)霍奇金淋巴瘤患者,在使用ABVD 方案化療后未出現(xiàn)肝功能損害,而加用CD30 單抗（布妥昔單抗）后乙肝病毒復(fù)制顯著增加,并發(fā)急性肝衰竭[15],推測(cè)CD30 可能具有抑制病毒活動(dòng)的作用,而CD30表達(dá)降低會(huì)促進(jìn)乙肝病毒激活[16]。本文HBV-ACLF組外周血中sCD30 水平的升高需要考慮多種因素的影響,一種可能的解釋是,在HBV-ACLF 病毒感染和炎癥反應(yīng)過(guò)程級(jí)聯(lián)性增強(qiáng)時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生更多的CD30,并不一定意味著CD30 抑制病毒活動(dòng)的作用增強(qiáng)。另一種可能的解釋是,CD30 的抑制作用是與其表達(dá)水平的變化有關(guān),而外周血中sCD30 水平的升高主要反映活化CD30 水平,sCD30 水平的升高是由于CD30 產(chǎn)生和分泌增加,CD30 被釋放到外周血中,并不一定在組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其抑制病毒作用。此外,CD30 分子在體內(nèi)的功能和作用還受到多種因素的影響,如細(xì)胞因子、炎癥反應(yīng)和免疫狀態(tài)等。因此,即使外周血中sCD30 水平升高,CD30 的抑制作用也不一定會(huì)增強(qiáng),CD30 的抑制作用仍可能會(huì)減弱,從而導(dǎo)致乙肝病毒的激活。總的來(lái)說(shuō),HBV-ACLF 組血漿sCD30 水平升高可能與病毒復(fù)制有關(guān),但具體的關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。歐洲臨床微生物與感染性疾病學(xué)會(huì)（ESCMID）宿主感染研究小組建議在使用布妥昔單抗前需排除巨細(xì)胞病毒、慢乙肝病毒等感染[17]。ZHANG 等[18]實(shí)驗(yàn)顯示重度慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD30 mRNA 表達(dá)顯著高于正常組及輕中度慢乙肝組。CD30 是非分泌蛋白,sCD30 系CD30 在胞外水解后的產(chǎn)物,檢測(cè)外周血sCD30 可反映CD30 表達(dá)水平。

本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組、慢乙肝組及HBV-ACLF 組年齡、血小板、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、血清鈉、白蛋白、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素氮比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。HBV-ACLF 組血漿sCD30 水平高于對(duì)照組及慢乙肝組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,對(duì)照組與慢乙肝組sCD30 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。sCD30 作為免疫相關(guān)蛋白,在病毒復(fù)制活躍時(shí),細(xì)胞破壞明顯,體內(nèi)免疫反應(yīng)隨之活躍,導(dǎo)致sCD30 表達(dá)明顯升高,而在病毒復(fù)制靜止期及免疫耐受期,sCD30 表達(dá)受到一定影響[19-20]。慢加急性肝衰竭患者處于免疫激活狀態(tài),促使肝病的迅速進(jìn)展[3]。本研究結(jié)果顯示,sCD30 對(duì)診斷HBV-ACLF 的特異度為80%,結(jié)合HBV-DNA 診斷HBV-ACLF 的特異度升至87%,對(duì)診斷HBV-ACLF 具有一定的價(jià)值。已有研究證實(shí)sCD30 在慢乙肝活動(dòng)期中的診斷價(jià)值[21],隨著后期臨床試驗(yàn)的開(kāi)展,CD30 對(duì)HBV-ACLF 的治療潛力有望展現(xiàn)。

根據(jù)以上分析,聯(lián)合測(cè)定sCD30 和HBV-DNA可以為臨床上診斷HBV-ACLF 提供一定的幫助。sCD30 水平升高可能是ACLF 的一個(gè)標(biāo)志性指標(biāo),而HBV-DNA 定量是評(píng)估乙肝病毒感染活動(dòng)性和疾病進(jìn)展程度的重要指標(biāo),因此,同時(shí)檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)可以為臨床醫(yī)生提供更全面的病情評(píng)估,并有助于早期發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF 患者。ACLF 病情進(jìn)展迅速,治療效果差,病死率高,如果能夠及時(shí)診斷并采取相應(yīng)的治療措施,可以有效地控制病情進(jìn)展,改善患者的預(yù)后,聯(lián)合測(cè)定sCD30 和HBV-DNA 不僅可以提高HBV-ACLF 的診斷準(zhǔn)確性,還可以促進(jìn)早期干預(yù)和治療,降低患者的病死率和并發(fā)癥發(fā)生率,提高患者的生活質(zhì)量,對(duì)HBV-ACLF 患者的管理和治療具有重要的臨床意義。