宋志勇 穆亞敏 汪勇 李芳芳

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)以記憶能力下降和行為異常等為主要臨床表現(xiàn),其主要病理機(jī)制為腦組織的氧化性應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞丟失或凋亡,進(jìn)而引發(fā)腦組織結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致患者記憶功能障礙[1]。目前臨床主要采用西藥(如鹽酸多奈哌齊)治療,雖能緩解患者臨床癥狀,但患者可出現(xiàn)心血管以及胃腸道等系統(tǒng)的不良反應(yīng)。研究顯示中醫(yī)藥在改善AD患者的記憶和學(xué)習(xí)障礙方面顯示了較為滿意療效[2]。參附注射液是由人參、黑附子等中藥提取而成的中成藥注射劑,在臨床上廣泛用于慢性心衰、心肌梗死、失血性休克等心血管疾病的治療[3]。近年來研究結(jié)果顯示參附注射液對神經(jīng)細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用,但具體機(jī)制尚未闡明[4]。胚胎發(fā)育相關(guān)音速波狀蛋白(sonic hedgehog,SHH)通路在細(xì)胞生長、分化、凋亡以及衰老等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用,參與組織損傷的修復(fù)、炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激等病理生理過程[5]。Yu等[6]研究發(fā)現(xiàn),激活SHH通路能明顯抑制大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注大鼠模型神經(jīng)元的異常凋亡,改善大鼠神經(jīng)功能缺損。SHH信號是否參與AD進(jìn)展尚不清楚。本研究參照Xiong等[7]制備AD小鼠,從SHH 信號入手,以SHH信號特異性抑制劑環(huán)巴胺(cyclopamine,CPA)行挽救實(shí)驗(yàn),探討參附注射液對AD小鼠腦組織的保護(hù)作用及可能機(jī)制,為疾病的臨床治療提供新的角度。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物雄性7～8周齡SPF級C57BL/6小鼠60只,平均體重為(28±3)g,購自上海泰槿生物技術(shù)有限公司湘潭分公司〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2022-0004〕。小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。喂養(yǎng)條件:12 h明/暗交替,相對濕度(50±5)%,溫度(23±2)℃,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水與攝食。按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常組、AD模型組、參附注射液(低、中、高劑量)干預(yù)組、參附注射液+CPA干預(yù)組(以下簡稱CPA干預(yù)組),每組10只。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會審批通過(2022-0725-6M188)。

1.2 主要試劑和儀器參附注射液(10 mL/支,國藥準(zhǔn)字Z20043117;雅安三九藥業(yè)有限公司),D-半乳糖(山東富禾生物科技有限公司),CPA(美國Sigma公司),兔抗小鼠SHH、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B細(xì)胞白血病-淋巴瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、β淀粉樣蛋白(amyloid-beta peptide,Aβ)、甘油醛三磷酸脫氫酶(glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase,GAPDH)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)ELISA試劑盒、TUNEL染色試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司),TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-PCR(rRT-PCR)試劑盒(大連TaKaRa公司),免疫組化、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)試劑盒(北京中杉金橋有限公司),PBS(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。低溫石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司),光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus公司),凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司),超凈工作動(dòng)臺(江蘇榮華儀器制造有限公司),JEM-3300透射電鏡(日本電子株式會社),BXS-201小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)儀(北京北廣精儀儀器設(shè)備有限公司),BA-200避暗自動(dòng)測試儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1AD模型制備及分組:參考Xiong等[7]方法制備AD小鼠模型。按體重0.14 g/(kg·d)給予小鼠皮下注射1% D-半乳糖,連續(xù)3周;隨后按體重2 mg /(kg·d)腹腔注射東莨菪堿,持續(xù)注射2周后對小鼠進(jìn)行評估,行走時(shí)出現(xiàn)原地轉(zhuǎn)圈或無法行走等現(xiàn)象視為造模成功。正常組小鼠以相同方法給予生理鹽水。低、中、高劑量參附注射液組小鼠于造模開始后分別按體重10、15、20 mL/(kg·d)接受參附注射液灌胃,CPA干預(yù)組小鼠于造模開始后按體重20 mL/kg接受參附注射液灌胃,同時(shí)按體重5 mg/kg給予腹腔注射CPA,連續(xù)給藥8周;正常組和AD模型組小鼠按相同方法給予生理鹽水替代。

1.3.2記憶功能檢測[8]:結(jié)束給藥后,所有小鼠進(jìn)行小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)和避暗自動(dòng)測試儀檢測,記錄小鼠的潛伏時(shí)間(小鼠第一次跳下跳臺后進(jìn)入暗室的時(shí)間)和錯(cuò)誤次數(shù)(小鼠5 min內(nèi)跳下跳臺的次數(shù))。

1.3.3小鼠腦組織病理檢測:記憶功能檢測完畢后,處死各組小鼠,并剪取每只小鼠1 g腦組織,將腦組織置10%(質(zhì)量濃度)中性甲醛進(jìn)行固定并切片(片厚約為4 μm),行HE染色、封片,置顯微鏡下觀察小鼠腦組織的病理改變。

1.3.4小鼠腦組織細(xì)胞凋亡檢測:剪取每只小鼠1 g腦組織,置10%(質(zhì)量濃度)中性甲醛緩沖液固定后包埋、切片(片厚約為4 μm),行TUNEL染色、孵育,置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5腦組織SOD和MDA測定:剪取每只小鼠1 g腦組織,經(jīng)裂解、離心后按ELISA試劑盒步驟測定各組小鼠腦組織SOD和MDA水平。

1.3.6小鼠腦組織Aβ表達(dá)檢測:采用免疫組化法進(jìn)行檢測。剪取每只小鼠1 g腦組織,常規(guī)固定、脫水、包埋、切片,封閉玻片,加入已稀釋好的兔抗小鼠Aβ抗體(1∶500),置于4℃下,孵育24 h,PBS洗滌,加入二抗(1∶1500),用蘇木精復(fù)染,顯微鏡下觀察,視野中出現(xiàn)棕黃色顆粒表示Aβ陽性細(xì)胞表達(dá)。

1.3.7各組小鼠腦組織SHH通路蛋白mRNA表達(dá)檢測[9]:采用rRT-PCR法進(jìn)行檢測。剪取每只小鼠1 g腦組織,TRIzol法提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒在ABI 7500 Fast系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。U6用作加載對照參照,通過2-ΔΔCt計(jì)算跨膜蛋白受體1(Patched1,Ptch1)、跨膜蛋白(Smoothened,SMO)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(glioma-associated oncogene family zinc finger1,GLI1)基因相對表達(dá)水平。qPCR擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 RNA的引物序列

1.3.8Western blot檢測:剪取每只小鼠1 g腦組織,常規(guī)提取總蛋白,電泳分離,轉(zhuǎn)膜,清洗,封閉,置室溫下孵育2 h,加入一抗(1∶500),孵育過夜,加入二抗(1∶1 000),顯色,以GAPDH作為內(nèi)參。檢測各組小鼠腦組織SHH、Ptch1、SMO、GLI1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Shapiro-Wilk法和Brown-Forsythe法分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠記憶功能比較與正常組相比,AD模型組、參附注射液(低、中、高劑量)干預(yù)組、CPA干預(yù)組小鼠的記憶潛伏時(shí)間下降(均P<0.05),錯(cuò)誤次數(shù)增多(均P<0.05);與AD模型組相比,參附注射液(低、中、高劑量)干預(yù)組、CPA干預(yù)組小鼠的記憶潛伏時(shí)間升高(均P<0.05),錯(cuò)誤次數(shù)下降(均P<0.05),且具有明顯的劑量依賴性(均P<0.05);與參附注射液高劑量干預(yù)組相比,CPA干預(yù)組小鼠的記憶潛伏時(shí)間下降,錯(cuò)誤次數(shù)升高(均P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果比較

2.2 各組小鼠腦組織病理檢測HE染色結(jié)果顯示,正常組小鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可辨,胞膜完整,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器未見異常;AD模型組小鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂,胞膜或凹陷或缺損,胞間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤,胞核明顯縮小,核膜破裂,線粒體呈現(xiàn)空泡樣變性,染色體固縮嚴(yán)重;與AD模型組相比,參附注射液(低、中、高劑量)干預(yù)組小鼠腦組織病理損傷明顯改善,炎性浸潤明顯減輕,染色體固縮明顯緩解,其中高劑量組小鼠腦組織的細(xì)胞狀態(tài)趨于正常;而CPA干預(yù)組小鼠腦組織病理損傷較參附注射液高劑量干預(yù)組明顯加重,細(xì)胞界限趨于模糊,核質(zhì)界限不明朗。結(jié)果見圖1。

2.3 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率和Aβ表達(dá)與正常組比較,AD模型組、不同濃度參附注射液干預(yù)組及CPA干預(yù)組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率和Aβ表達(dá)升高(均P<0.05);與AD模型組比較,CPA干預(yù)組以及參附注射液低、中、高劑量干預(yù)組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率和Aβ表達(dá)降低(均P<0.05),且具有明顯的劑量依賴性(均P<0.05);與參附注射液高劑量干預(yù)組小鼠比較,CPA干預(yù)組腦組織細(xì)胞凋亡率和Aβ表達(dá)明顯升高(均P<0.05)。結(jié)果見圖2～3,表3。

表3 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡及SOD、MDA及Aβ表達(dá)情況比較

2.4 各組小鼠腦組織SOD和MDA水平比較與正常組相比,AD模型組、CPA干預(yù)組、參附注射液低、中、高劑量干預(yù)組小鼠腦組織SOD水平明顯降低,MDA水平明顯升高(均P<0.05);與AD模型組相比,CPA干預(yù)組以及參附注射液低、中、高劑量組小鼠腦組織SOD水平明顯升高,MDA水平降低(均P<0.05),且具有明顯的劑量依賴性(均P<0.05);與參附注射液高劑量組相比,CPA干預(yù)組小鼠腦組織SOD水平明顯降低,MDA水平明顯升高(均P<0.05)。結(jié)果見表3。

2.5 各組小鼠腦組織Ptch1、SMO、GLI1表達(dá)與正常組相比,AD模型組、CPA干預(yù)組以及不同劑量參附注射液干預(yù)組小鼠腦組織Ptch1、SMO、GLI1 mRNA表達(dá)明顯降低(均P<0.05);與AD模型組相比,CPA干預(yù)組以及不同劑量參附注射液干預(yù)組小鼠腦組織Ptch1、SMO、GLI1 mRNA表達(dá)明顯升高(均P<0.05),且具有明顯的劑量依賴性(均P<0.05);與參附注射液高劑量組相比,CPA干預(yù)組小鼠腦組織Ptch1、SMO、GLI1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

注:AD:阿爾茨海默病;CPA:環(huán)巴胺;A:正常組;B:AD模型組;C:參附注射液低劑量組;D:參附注射液中劑量組;E:參附注射液高劑量組;F:CPA干預(yù)組

注:AD:阿爾茨海默病;CPA:環(huán)巴胺;A:正常組;B:AD模型組;C:參附注射液低劑量組;D:參附注射液中劑量組;E:參附注射液高劑量組;F:CPA干預(yù)組

注:AD:阿爾茨海默病;CPA:環(huán)巴胺;A:正常組;B:AD模型組;C:參附注射液低劑量組;D:參附注射液中劑量組;E:參附注射液高劑量組;F:CPA干預(yù)組

表4 各組小鼠腦組織Ptch1、SMO、GLI1mRNA相對表達(dá)水平比較

2.6 各組小鼠腦組織SHH、Ptch1、SMO、GLI1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與正常組相比,AD模型組、CPA干預(yù)組以及不同劑量參附注射液干預(yù)組小鼠腦組織SHH、Ptch1、SMO、GLI1、Bcl-2表達(dá)降低,Bax 表達(dá)明顯升高(均P<0.05);與AD模型組相比,CPA干預(yù)組以及不同劑量參附注射液干預(yù)組小鼠腦組織SHH、Ptch1、SMO、GLI1、Bcl-2表達(dá)升高,Bax 表達(dá)降低(均P<0.05),且具有明顯的劑量依賴性(P<0.05);與參附注射液高劑量組相比,CPA干預(yù)組小鼠腦組織SHH、Ptch1、SMO、GLI1、Bcl-2表達(dá)降低,Bax 表達(dá)升高(均P<0.05)。結(jié)果見圖4、5。

注:SHH:胚胎發(fā)育相關(guān)音速波狀蛋白;Ptch1:跨膜蛋白受體1;SMO:跨膜蛋白;GLI1:鋅指轉(zhuǎn)錄因子1;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:B細(xì)胞白血病-淋巴瘤-2相關(guān)蛋白;AD:阿爾茨海默病;CPA:環(huán)巴胺;1、2、3:分別為參附注射液低、中、高劑量干預(yù)組

3 討論

AD患者具有智力低下、情感障礙以及日常生活不能自理等特點(diǎn),目前尚無有效的治療方案。隨著我國老齡化社會的進(jìn)展,該病發(fā)病率逐年升高,給患者家庭帶來沉重負(fù)擔(dān),給我國公共衛(wèi)生事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[10]。因此,尋找一種可靠的有效的治療方案具有重要意義。

本研究參考文獻(xiàn)[7]方法制備AD模型,給予小鼠皮下注射1%D-半乳糖可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)亞急性衰老狀態(tài),接著給予腹腔注射東莨菪堿來損傷膽堿能受體,進(jìn)而制備AD小鼠,更加貼合機(jī)體內(nèi)AD復(fù)雜而又有步驟的病理變化過程。本研究結(jié)果顯示,AD模型組小鼠較正常組小鼠記憶功能明顯下降,腦組織病理損傷明顯加重,腦組織Aβ富集,表明AD造模成功。

注:SHH:胚胎發(fā)育相關(guān)音速波狀蛋白;Ptch1:跨膜蛋白受體1;SMO:跨膜蛋白;GLI1:鋅指轉(zhuǎn)錄因子1;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:B細(xì)胞白血病-淋巴瘤-2相關(guān)蛋白;AD:阿爾茨海默病;CPA:環(huán)巴胺;與正常組相比,aP<0.05;與AD模型組相比,bP<0.05;與參附注射液低劑量組相比,cP<0.05;與參附注射液中劑量組相比,dP<0.05;與參附注射液高劑量組相比,eP<0.05

AD的病理機(jī)制尚處在實(shí)驗(yàn)探究階段,其中自由基富集、胰島素相關(guān)糖代謝異常、淀粉樣蛋白(如Aβ表達(dá)驟增)積聚、氧化以及炎性應(yīng)激均在AD的病理進(jìn)展中發(fā)揮作用。毋庸置疑的是,AD患者腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞的異常凋亡或丟失可導(dǎo)致患者出現(xiàn)記憶功能障礙[11]。目前,西藥療效的不穩(wěn)定性、肝腎毒作用以及對胃腸道的刺激作用成為AD臨床治療的困擾。中藥中某些具有特異性結(jié)構(gòu)的藥物前體或提取物因其作用靶點(diǎn)明確、副反應(yīng)小、來源廣泛成為國內(nèi)外研究學(xué)者的聚焦點(diǎn)。參附注射液是參照傳統(tǒng)益氣固脫名方參附湯結(jié)合現(xiàn)代中藥制藥工藝研制而成,其主要活性組分是人參皂苷和烏頭堿類生物堿,具有降血脂、抗血栓、延緩動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化以及穩(wěn)定斑塊的作用[12]。Gu等[13]研究表明,參附注射液能夠抑制心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激,改善心臟停搏復(fù)蘇豬的心功能障礙。陳瑞娟等[14]研究顯示,參附注射液能夠下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度,抑制由此導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,緩解血管內(nèi)皮損傷。盧璽宇等[15]研究證實(shí)將參附注射液用于輔助治療急性重型腦外傷的臨床干預(yù)中,有助于幫助患者恢復(fù)神經(jīng)功能,縮短住院時(shí)間,提升治療效果。目前有關(guān)參附注射液在AD中的治療研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示,與模型組相比,參附注射液低、中、高劑量組小鼠記憶功能明顯好轉(zhuǎn),腦組織中Aβ的表達(dá)明顯降低,腦組織病理損傷明顯減輕,細(xì)胞的凋亡率明顯下降,腦組織中抗氧化酶SOD的含量明顯升高,物質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量明顯降低,細(xì)胞的凋亡率明顯下降,這些指標(biāo)的變化均具有明顯劑量依賴性,表明參附注射液可通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來干預(yù)AD疾病進(jìn)展,緩解腦組織病理損傷,進(jìn)而改善實(shí)驗(yàn)小鼠記憶功能。

深入揭示藥物的作用靶點(diǎn),不僅有助于闡明疾病進(jìn)展的分子機(jī)制,還有助于藥物在臨床治療領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。研究表明,AD是多基因調(diào)控下多種靶細(xì)胞協(xié)同作用的共同結(jié)果,此過程中還涉及許多信號通路的參與[16]。SHH基因定位在染色體7q36,其編碼的蛋白是一種具有種屬特異性的糖蛋白。SHH信號主要由SHH、Ptch1以及其系列蛋白因子、SMO、膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子GLI1以及其系列蛋白等組成。AD病理進(jìn)展中Aβ的大量聚集導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)較為嚴(yán)重的氧化應(yīng)激,腦組織中SOD和MDA水平失調(diào),導(dǎo)致SHH的轉(zhuǎn)錄以及合成受阻,進(jìn)而其跨膜受體Ptch1的表達(dá)下調(diào),偶聯(lián)受體跨膜蛋白SMO以及下游核轉(zhuǎn)錄因子GLI1的轉(zhuǎn)導(dǎo)受限,SHH通路的傳導(dǎo)受阻,細(xì)胞核內(nèi)抗凋亡Bcl-2與促凋亡Bax蛋白的表達(dá)失衡,腦組織產(chǎn)生大量的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[17]。Zhao等[18]研究顯示,在大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型中,激活SHH通路能明顯改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的記憶缺損,緩解動(dòng)物腦組織的病理和超微結(jié)構(gòu)損傷。本研究結(jié)果顯示,與AD模型組相比,不同劑量參附注射液干預(yù)組小鼠腦組織Ptch1、SMO、GLI1 mRNA表達(dá)升高,SHH蛋白表達(dá)升高,以及Bcl-2和Bax 表達(dá)失衡明顯緩解,經(jīng)SHH特異性抑制劑CPA干預(yù)后顯示,CPA能部分逆轉(zhuǎn)參附注射液對腦組織的神經(jīng)保護(hù)作用,表明參附注射液能夠激活SHH通路的傳導(dǎo)。

綜上所述,參附注射液能明顯降低AD模型小鼠腦組織的氧化應(yīng)激,下調(diào)腦組織神經(jīng)元的凋亡,緩解AD小鼠的腦損傷,其作用機(jī)制可能與激活SHH信號有關(guān)。但是將參附注射液引入AD的臨床治療時(shí),仍需結(jié)合患者個(gè)體病情進(jìn)展的狀況,給予合適的劑量以及頻次。