盧葦 尤紅 張敏

腦出血是神經(jīng)外科常見疾病之一,起病急,具有高致死率和高致殘率的特點,30 d死亡率高達(dá)50%,僅有2%的患者在6個月后能恢復(fù)生活自理能力,給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。腦出血的原因主要系非創(chuàng)傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管發(fā)生破裂,導(dǎo)致腦實質(zhì)內(nèi)血液聚集,引起一系列神經(jīng)功能缺損,常見出血部位為基底節(jié)、小腦、腦干等部位。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致腦出血后嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷,誘導(dǎo)大量自由基的產(chǎn)生并促使腦水腫的發(fā)生及脂質(zhì)過氧化,損害機(jī)體神經(jīng)功能。抑制氧化應(yīng)激可以減輕這種損害[2]。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是主要的抗氧化應(yīng)激通路,激活該通路可促進(jìn)機(jī)體抗氧化應(yīng)激酶的表達(dá),利于清除自由基,從而對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用?，F(xiàn)就Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路調(diào)控腦出血后氧化應(yīng)激相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為其臨床研究提供參考。

1 腦出血后繼發(fā)性腦損傷機(jī)制

除腦出血后的腫塊效應(yīng)引起腦組織原發(fā)性損傷外,腦出血引起的氧化應(yīng)激等還可引起繼發(fā)性腦損傷[3]。腦出血最常見的病因是高血壓,長期高血壓導(dǎo)致血管壁發(fā)生玻璃樣變性,血管痙攣后破裂出血,隨后發(fā)生氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、紅細(xì)胞溶解并釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)、興奮性谷氨酸毒性、線粒體功能障礙及炎癥反應(yīng)等導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生[4]。同時,人體存在抗氧化系統(tǒng),當(dāng)自由基大量生成超過機(jī)體抗氧化能力時,將啟動Keap1/Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激信號通路,并激活其下游抗氧化酶的表達(dá),以減少自由基的產(chǎn)生,減輕出血后繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性腦損傷將通過以下多種機(jī)制促使神經(jīng)元凋亡及壞死,引起神經(jīng)功能嚴(yán)重障礙。

1.1 氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激可引起神經(jīng)元大量壞死,其原因主要為自由基的產(chǎn)生超過抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力[5],即活性氧(ROS)和活性氮產(chǎn)生過多。ROS是由氧自由基和非自由基氧化劑組成的分子[6],在生理條件下受抗氧化體系的調(diào)節(jié)并保持在低水平。ROS既可以通過調(diào)節(jié)激酶、磷酸酶、氧化還原酶敏感轉(zhuǎn)錄因子等參與細(xì)胞信號通路,以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡,又可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)殺死病原體而維持機(jī)體正?；顒覽7];另外ROS還可增加機(jī)體抗氧化能力和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。腦出血后,ROS釋放進(jìn)一步增多,過量的ROS超過機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的能力時,不但可直接氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA并參與細(xì)胞死亡信號通路而損傷細(xì)胞[9],還可破壞血腦屏障、引起神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)炎癥等,對大腦產(chǎn)生損傷?；钚缘橇硪环N重要的自由基,主要由一氧化氮(NO)及其衍生物組成[6],NO由NO合酶在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生。在生理條件下,NO介導(dǎo)神經(jīng)傳遞,調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生存、增殖和分化。但在病理條件下,NO常引起毛細(xì)血管通透性改變、血腦屏障功能障礙,進(jìn)而促使神經(jīng)細(xì)胞損傷,過量的NO可通過多種機(jī)制導(dǎo)致氧化應(yīng)激,另外,NO與過氧亞硝基陰離子發(fā)生反應(yīng)可引起蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的氧化和硝化[3]。腦組織易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,其原因為腦組織富含脂類和鐵,相對缺乏抗氧化劑[10],如Nrf2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、血紅素加氧酶1(HO-1)等。研究表明,腦出血后大腦中的ROS水平隨著抗氧化酶的減少而增加[11],提示抗氧化應(yīng)激可改善腦出血后神經(jīng)功能缺損癥狀,減輕炎癥反應(yīng)并降低脂質(zhì)過氧化。

1.2 小膠質(zhì)細(xì)胞激活小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)廣泛分布的固有免疫細(xì)胞,可促進(jìn)血腫吸收并誘導(dǎo)神經(jīng)和血管生成,主要維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并識別炎癥刺激的應(yīng)激信號[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞包括兩種亞型,即促炎型(M1型)和抗炎型(M2型)。腦出血后在凝血酶等的刺激下,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化[13],使超氧化物高表達(dá)并生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶,進(jìn)而釋放大量的ROS和活性氮,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙[14],導(dǎo)致腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等多種促炎細(xì)胞毒性因子產(chǎn)生,導(dǎo)致神經(jīng)毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)功能缺損。

1.3 紅細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)腦出血后,紅細(xì)胞降解產(chǎn)物血紅蛋白、血紅素、膽紅素等在周圍實質(zhì)中積累[15],血紅蛋白是引起氧化應(yīng)激損傷的主要調(diào)節(jié)物,而血紅蛋白氧化損傷的主要途徑是促使自由基的產(chǎn)生[10]。血紅素作為一種親脂性物質(zhì),通過脂蛋白受體相關(guān)蛋白運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)的氯化血紅素(hemin)被降解成Fe2+、膽紅素和一氧化碳,Fe2+通過芬頓反應(yīng)生成羥基自由基,造成ROS含量明顯增加[16],破壞生物膜的穩(wěn)定性,降低細(xì)胞對氧化損傷的耐受性,進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化性死亡;此外,血紅素還具有促炎作用。膽紅素濃度升高時可導(dǎo)致神經(jīng)毒性。

1.4 興奮性氨基酸毒性腦出血后,谷氨酸生成增多,過多的谷氨酸聚集將激活腦內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸受體[17],促進(jìn)Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,Ca2+內(nèi)流可激活神經(jīng)元NO合酶促使NO生成,Ca2+超載可激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOXs)促進(jìn)超氧化物的生成[18],且NO與超氧化物聚合可形成過氧亞硝酸鹽,均會對DNA產(chǎn)生損傷。

1.5 炎癥反應(yīng)腦出血后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的組織損傷還可觸發(fā)炎癥反應(yīng)并釋放炎癥介質(zhì),炎癥介質(zhì)又可直接誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可激活氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子,如激活蛋白1和核因子kappaB(NF-κB)[19],并將炎癥細(xì)胞召集到損傷部位,導(dǎo)致促炎因子大量釋放,如NADPH氧化酶等。有研究證實,Nrf2相關(guān)信號通路可以下調(diào)NF-κB使小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)化[20]。

1.6 線粒體功能障礙線粒體主要負(fù)責(zé)能量代謝并調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)。腦出血后,線粒體內(nèi)膜陰離子通道(IMAC)打開并伴隨通透性過渡孔(MPTP)的開放[21],導(dǎo)致氧化環(huán)境的改變,并觸發(fā)ROS的釋放,高水平的ROS結(jié)合持續(xù)激活的線粒體通透性過渡孔,導(dǎo)致ROS爆發(fā)[22],加劇線粒體損傷,形成嚴(yán)重的惡性循環(huán),另外還可使ATP生成減少[23],引起神經(jīng)元損傷及機(jī)體穩(wěn)態(tài)失調(diào),導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。

綜上所述,腦出血后ROS增多超過機(jī)體抗氧化能力由多種原因引起,ROS增多時不僅會引起氧化應(yīng)激損傷,還會激活A(yù)TM/ATR-p53通路,導(dǎo)致細(xì)胞衰老或細(xì)胞死亡;此外,還可激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)-p38/c-Jun N端激酶(JNK)通路[24],導(dǎo)致細(xì)胞死亡,對神經(jīng)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害。因此,減少ROS的生成是降低出血后氧化應(yīng)激并保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的一種重要方法。

2 Keap1/Nrf2/ARE通路作用機(jī)制

腦出血后,大腦中的ROS水平隨著抗氧化酶的減少而增加[11],而抗氧化應(yīng)激可改善腦出血后神經(jīng)功能并降低炎癥反應(yīng)。Keap1/Nrf2/ARE信號通路對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的調(diào)控作用[25],通過調(diào)節(jié)細(xì)胞防御酶對抗氧化應(yīng)激和/或親電應(yīng)激[26],是重要的抗氧化應(yīng)激通路。

2.1 Keap1-Nrf2-ARE概況1999年Itoh等通過酵母雙雜交技術(shù)篩選分離出一種新的富硫蛋白和Nrf2的負(fù)調(diào)控因子[27],并將其命名為Keap1。Keap1至少含有27個半胱氨酸殘基,且具有不同的反應(yīng)性水平,是Nrf2的氧化應(yīng)激傳感器和負(fù)調(diào)控因子[28]。Nrf2是一種具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子[29],是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)劑,主要通過轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)而發(fā)揮作用,這些基因在其啟動子區(qū)域中攜帶一種被稱為ARE的特定序列。在生理狀態(tài)下,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中被錨定在Keap1上,與Keap1偶聯(lián)形成二聚體,Nrf2/Keap1二聚體與泛素連接酶Clu3形成復(fù)合物,介導(dǎo)Nrf2泛素化蛋白酶途徑降解,使胞內(nèi)Nrf2呈低水平負(fù)調(diào)控狀態(tài)[30]。Keap1可將Nrf2隔離并阻止其轉(zhuǎn)錄活性[31],并通過Keap1的BTB(Broad complex,Tramtrack和Bric-à-Brac)結(jié)構(gòu)域被泛素蛋白酶體系統(tǒng)快速降解致Nrf2泛素化[32]。

2.2 Keap1/Nrf2/ARE信號通路抗氧化應(yīng)激機(jī)制當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時,Keap1作為氧化還原敏感的開關(guān),被ROS和活性氮等修飾半胱氨酸殘基并使其構(gòu)象發(fā)生改變[33],抑制Nrf2泛素化、促進(jìn)磷酸化可使Nrf2-Keap1二聚體解偶聯(lián)后促使Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核,Nrf2穩(wěn)定增加并與ARE結(jié)合,啟動下游醌NADH脫氫酶(NQO-1)、HO-1等抗氧化應(yīng)激基因的轉(zhuǎn)錄[34],進(jìn)而調(diào)節(jié)抗氧化酶(過氧化氫酶等)和炎癥損傷蛋白的表達(dá)[35],發(fā)揮清除ROS和活性氮、抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。

2.3 腦出血后Keap1/Nrf2/ARE信號通路作用機(jī)制腦出血后,機(jī)體通過氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、紅細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)等途徑產(chǎn)生大量自由基,隨后激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路,Nrf2作為氧化反應(yīng)途徑的守護(hù)者,可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[36],該信號通路在保護(hù)大腦免受出血引起的氧化損傷中發(fā)揮重要作用[37]。有研究結(jié)果顯示,虎杖苷、白藜蘆醇均可通過調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路和下游基因表達(dá),減少氧化應(yīng)激反應(yīng),在大鼠腦出血模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[38]。葛花、枳椇子及其配伍組合通過調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE信號通路,在急性酒精性肝損傷小鼠中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[39]。另外,鞣花酸可抑制Keap1導(dǎo)致Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)積聚,以減少氧化應(yīng)激對帕金森病患者神經(jīng)元細(xì)胞的影響[40]。因此,Keap1/Nrf2/ARE信號通路作為最重要的抗氧化應(yīng)激通路,被激活后可對抗氧化應(yīng)激,改善神經(jīng)功能。

綜上所述,腦出血后繼發(fā)性損傷是一個復(fù)雜的過程,氧化應(yīng)激在此過程中起重要作用。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是體內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激通路,Nrf2可調(diào)節(jié)機(jī)體自由基的平衡及炎癥反應(yīng),并保護(hù)炎癥損傷后的細(xì)胞和組織,在調(diào)節(jié)腦出血后氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮非常重要的作用。腦出血后自由基釋放增多,激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路后,可啟動下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá),促進(jìn)自由基的清除,以抵抗氧化應(yīng)激損傷。因此,Keap1/Nrf2/ARE信號通路可作為治療腦出血后降低氧化應(yīng)激并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的方法;此外,Nrf2作為一個靶點,可能為改善腦出血后神經(jīng)功能障礙提供新的治療方向。