王松柏, 曾鈞發(fā), 王柏琦

南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤中心,湖南衡陽(yáng) 421001

肺癌根據(jù)其分化程度、形態(tài)特征和生物學(xué)特點(diǎn)分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。臨床上約80%的肺癌病例為NSCLC患者,目前仍無(wú)改善NSCLC患者生存率的有效措施[1]。異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)是一種人工合成單體,具有較好的抗腫瘤作用[2]。研究顯示,PEITC可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,且無(wú)細(xì)胞毒性[3]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),PEITC能夠抑制肺癌細(xì)胞侵襲[4],而其調(diào)控方式尚未完全闡明。

TMPRSS4是一種重要的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)[5]。TFPI-2是一種絲氨酸蛋白酶特異性抑制因子,也是一種潛在的抑癌基因,能夠影響TMPRSS4表達(dá)[6]。本研究探討PEITC對(duì)NSCLC A549、H1299細(xì)胞凋亡影響的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

PEITC(LKT Laboratories公司),TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司);pcDNA3.0-TMPRSS4過表達(dá)質(zhì)粒、siRNA-TFPI-2、pcDNA3.0-TMPRSS4(上海生物工程有限公司),pGL4.10-TMPRSS4真核表達(dá)質(zhì)粒(漢恒生物科技有限公司),TFPI-2抗體、β-actin抗體(Cell Signaling),細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司),DNA甲基化活性檢測(cè)試劑盒(上海銳賽生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌A549、H1299細(xì)胞系購(gòu)于ATCC公司。培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)采用0、30、50 μmol/L PEITC進(jìn)行后續(xù)處理,孵育結(jié)束后用于下一步研究。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

生長(zhǎng)于96孔板中的A549或H1299細(xì)胞經(jīng)PEITC處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后每孔中加入10 μL MTT試劑后再孵育4 h,隨后每孔加入150 μL二甲基亞砜,充分振蕩后在酶標(biāo)儀上設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定各孔的光密度(optical density,OD)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取上述處理后的細(xì)胞,采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,并用反轉(zhuǎn)錄試劑將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后加入引物對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增。其中20 μL反應(yīng)體系包括cDNA模板2 μL,2×反應(yīng)Mix 10 μL,上下游引物各0.6 μL,最后用無(wú)RNA酶的去離子水補(bǔ)充至總體系20 μL。PCR條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40個(gè)循環(huán)。TFPI-2上游引物為5′-AGACCGGTGAGCTGGATAG-3′,下游引物為5′-GTGATGTTGTGGTGGTGCC-3′;TMPRSS4上游引物5′-GACGAGGAGCACTGTGTCAA-3′,下游引物為5′-CTTCCCACAGGCAAGACAGT-3′;GAPDH上游引物為5′-AACCCATCACCATCTTCCAG-3′,下游引物為5′-CCAGTAGACTCCACGACATAC-3′。結(jié)果以2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞經(jīng)PEITC處理結(jié)束后,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,隨后在樣本中加入蛋白上樣緩沖液后煮沸,測(cè)定蛋白含量后行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,并用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。充分洗膜后加入一抗,4 ℃孵育12 h,再加HRP標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育2 h,最后ECL發(fā)光、顯影。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

收集經(jīng)過上述處理后的A549、H1299細(xì)胞。PBS緩沖液清洗細(xì)胞2～3次,1 500 r/min離心5 min。加入預(yù)冷75%乙醇,于4 ℃固定4 h,1 500 r/min離心5 min棄上清,再加入400 μL溴化乙錠(50 mg/L),100 μL RNase A(100 mg/L)4 ℃避光孵育30 min后檢測(cè)細(xì)胞周期。加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,隨后依次加入Annexin V-FITC和溴化乙淀溶液,37 ℃避光孵育后加入碘化丙啶進(jìn)行染色用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.7 甲基化特異性PCR

提取上述細(xì)胞DNA,純化后按照試劑盒說(shuō)明提供的方法建立反應(yīng)體系,其中10 μL反應(yīng)體系中包括5 μL PCR Mix、2 μL特異性引物、2 μL模板DNA和1 μL無(wú)酶水。置于PCR儀上,擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃ 30 s,56 ℃ 22 s,58 ℃ 32 s,35個(gè)循環(huán)。其中甲基化TFPI上游引物為5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′,下游引物為5′-ACGACCCGCTAAACAAAACG-3′;非甲基化TFPI-2上游引物為5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′,下游引物為5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。擴(kuò)增結(jié)束后分別將甲基化抑制劑5-aza-dc(陽(yáng)性對(duì)照)、陰性對(duì)照含等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液(ctrl)、10、30、50 μmol/L PEITC PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.8 甲基化活性分析

收集上述經(jīng)PEITC處理前后的總蛋白,測(cè)定其含量后,根據(jù)試劑盒提供的步驟,將15 μg蛋白樣品加入到含有胞嘧啶DNA孔中,隨后加入捕獲抗體,顯色后10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上設(shè)置波長(zhǎng)為450 nm,獲取各孔OD值,TFPI-2相對(duì)活性=(處理組活性O(shè)D/對(duì)照組活性O(shè)D)×100%。

1.9 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

采用轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的pGL4.10-TMPRSS4熒光質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞中,并以pGL4.10熒光質(zhì)粒作為對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后在上述細(xì)胞中加入裂解液,室溫孵育15 min。孵育完成后10 000 r/min離心10 min,取上清進(jìn)行TMPRSS4熒光素酶活性測(cè)定。

1.10 siRNA-TFPI-2與pcDNA3.0-TMPRSS4轉(zhuǎn)染

siRNA沉默TFPI-2分為空白組(加入等體積培養(yǎng)基)、siRNA組(RNA對(duì)照)和轉(zhuǎn)染組(TFPI-2 siRNA)。將長(zhǎng)勢(shì)良好的A549和H1299加入至6孔板中培養(yǎng),隨后將siRNA-TFPI-2加入至6孔板中,孵育20 h后棄去上清,并加入新完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h進(jìn)行傳代。50 μmol/L PEITC處理細(xì)胞48 h,Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TFPI-2的表達(dá)水平,以評(píng)估RNA干擾效果,所用干擾序列分別為5′-CAGCATGAGGAAACAAATCAT-3′和5′-TTGCAATGCATAAGATATAAA-3′。TMPRSS4轉(zhuǎn)染時(shí)分為空白組(加入等體積培養(yǎng)基)、空載體組(加入等質(zhì)量pcDNA3.0質(zhì)粒)和轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.0-TMPRSS4)。在轉(zhuǎn)染前,將A549或H1299細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～90%時(shí),將培養(yǎng)基換成無(wú)抗生素和無(wú)血清培養(yǎng)基,2 h后根據(jù)Lipofetamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。50 μmol/L PEITC處理細(xì)胞48 h,觀察轉(zhuǎn)染效果并收集細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)比較采用Student-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PEITC抑制NSCLC細(xì)胞增殖

不同濃度PEITC處理A549、H1299細(xì)胞48 h后,細(xì)胞增殖水平均顯著降低(P<0.05),其中PEITC對(duì)A549細(xì)胞和H1299的IC50值分別為48.7 μmol/L和51.6 μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度PEITC對(duì)A549、H1299細(xì)胞增殖水平的影響a為P<0.05,與0 μmol/L比較;b為P<0.05,與10 μmol/L比較;c為P<0.05,與30 μmol/L比較。

2.2 PEITC誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞周期阻滯及凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,不同濃度PEITC均能顯著誘導(dǎo)A549、H1299細(xì)胞周期改變,表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例降低,G2和S期細(xì)胞比例增高(圖2A);隨著PEITC濃度的遞增,A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞凋亡率逐漸增高(圖2B)。

圖2 PEITC誘導(dǎo)A549和H1299細(xì)胞周期阻滯及凋亡A為不同濃度PEITC對(duì)A549、H1299細(xì)胞周期的影響;B為不同濃度PEITC對(duì)A549和H1299細(xì)胞凋亡的影響。

2.3 PEITC上調(diào)TFPI-2表達(dá)并抑制其甲基化

不同濃度PEITC處理細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)TFPI-2 mRNA及蛋白水平較未處理時(shí)顯著增高;TFPI-2甲基化酶活性降低,且當(dāng)PEITC 50 μmol/L時(shí),A549、H1299細(xì)胞中甲基化酶活性最低(圖3)。

圖3 PEITC對(duì)TFPI-2表達(dá)的影響A為TFPI-2蛋白水平;B為TFPI-2 mRNA表達(dá)水平;C為甲基化特異性PCR結(jié)果;D為甲基化酶活性。a為P<0.05,與0 μmol/L PEITC處理組同細(xì)胞比較;b為P<0.05,與10 μmol/L PEITC處理組同細(xì)胞比較;c為P<0.05,與30 μmol/L PEITC處理組同細(xì)胞比較。

2.4 PEITC抑制TMPRSS4表達(dá)

不同濃度PEITC處理細(xì)胞后,TMPRSS4表達(dá)水平均顯著降低,且呈濃度依賴性(圖4A)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)PEITC處理后,細(xì)胞TMPRSS4熒光素酶活性均顯著降低(圖4B)。

圖4 PEITC抑制TMPRSS4表達(dá)A為TMPRSS4蛋白表達(dá)水平;B為TMPRSS4基因活性。a為P<0.05,與0 μmol/L PEITC處理組同細(xì)胞比較;b為P<0.05,與10 μmol/L PEITC處理組同細(xì)胞比較;c為P<0.05,與30 μmol/L PEITC處理組同細(xì)胞比較。

2.5 沉默TFPI-2對(duì)細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染組A549、H1299細(xì)胞增殖率及TMPRSS4 mRNA均顯著高于空白組和siRNA組(圖5)。

圖5 沉默TFPI-2對(duì)A549和H1299細(xì)胞增殖和TMPRSS4 mRNA水平的影響A為細(xì)胞增殖;B為TMPRSS4 mRNA表達(dá)水平。1為空白組;2為siRNA組;3為轉(zhuǎn)染組。a為P<0.05,與空白組同細(xì)胞比較;b為P<0.05,與siRNA組同細(xì)胞比較。

2.6 過表達(dá)TMPRSS4對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-TMPRSS4過表達(dá)質(zhì)粒,顯示質(zhì)粒序列與目的序列相同,符合實(shí)驗(yàn)要求(圖6A、B)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-TMPRSS4質(zhì)粒后,A549、H1299細(xì)胞凋亡率顯著低于空白組、空載體組(圖6C)。

圖6 過表達(dá)TMPRSS4對(duì)A549和H1299細(xì)胞凋亡的影響A為pcDNA3.0-TMPRSS4過表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果;B為A549和H1299細(xì)胞過表達(dá)TMPRSS4鑒定結(jié)果;C為細(xì)胞凋亡。

3 討 論

PEITC作為人工合成的異硫氰酸化合物,是一種潛在的抗腫瘤藥物[7]。盡管尚未應(yīng)用于臨床,但大量研究證實(shí),PEITC能夠有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷移及侵襲[8-9]。盡管本課題組前期已經(jīng)證實(shí)了PEITC對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用,但其抗肺癌的分子機(jī)制尚未完全明確。本研究結(jié)果顯示,PEITC能夠通過抑制TFPI-2甲基化下調(diào)TMPRSS4表達(dá)進(jìn)而抑制A549和H1299細(xì)胞增殖。

腫瘤細(xì)胞的增殖分化通常受多種基因的調(diào)控,而TFPI-2是目前已知的一種重要的抑癌基因,其具有抑制腫瘤發(fā)展、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能[10-11]。研究表明,在肺癌細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染方法上調(diào)TFPI-2水平后可顯著降低細(xì)胞的增殖能力,表明TFPI-2是肺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子,也是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[12]。本研究采用PEITC處理肺癌細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)TFPI-2表達(dá)顯著增加,而采用siRNA沉默TFPI-2表達(dá)后,PEITC對(duì)A549、H1299細(xì)胞增殖的抑制作用出現(xiàn)了明顯的減弱,提示TFPI-2參與了PEITC對(duì)肺癌細(xì)胞的調(diào)控作用。TFPI-2啟動(dòng)子甲基化是影響TFPI-2體內(nèi)表達(dá)水平的重要因素。而在NSCLC患者體內(nèi)TFPI-2的甲基化水平較高,并且與腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)PEITC處理后,肺癌細(xì)胞內(nèi)TFPI-2的甲基化酶活性以及甲基化狀態(tài)的TFPI-2均顯著降低。因此,PEITC誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡可能與細(xì)胞內(nèi)TFPI-2表達(dá)增加,TFPI-2啟動(dòng)子甲基化水平降低有關(guān)。

TMPRSS4能夠參與細(xì)胞黏附、增殖、侵襲等多種細(xì)胞生物學(xué)功能[14-15]。TMPRSS4在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)。研究表明,TMPRSS4在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平要顯著高于癌旁組織,而下調(diào)TMPRSS4的表達(dá)則可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖與遷移[7,16]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí),PEITC能下調(diào)A549、H1299細(xì)胞中TMPRSS4的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-TMPRSS4質(zhì)粒后,細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證之前的結(jié)論。

綜上,PEITC能抑制TFPI-2甲基化,從而下調(diào)TMPRSS4表達(dá),影響A549及H1299細(xì)胞的增殖活性并誘導(dǎo)其凋亡;提示TFPI-2、TMPRSS4可能是肺癌治療的新靶點(diǎn)。