黎文濤, 伍小瓊, 馮志鵬, 王正根

1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科,湖南衡陽 421001;2.湖南師范大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院消化內(nèi)科,湖南岳陽 414000

胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)是惡性程度極高的腫瘤[1]。作為預(yù)后極差的消化系統(tǒng)腫瘤,胰腺癌具有早期診斷困難、手術(shù)切除率低、術(shù)后易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等臨床特點,總體5年生存率不足8%,臨床診治極具挑戰(zhàn)性[2]。鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化、活性氧過量產(chǎn)生所致的細(xì)胞死亡類型。目前研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[3]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控活動,通過調(diào)控靶基因表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并參與鐵死亡的調(diào)控[4]。本研究探討miR-199過表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和Panc-1鐵死亡的作用及其調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3和Panc-1(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所),轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國),DMEM培養(yǎng)基(Sigma,美國),雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Qiagen,美國),TRIzol熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific,美國),miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker(康為世紀(jì),中國),谷胱甘肽(glutathione,GSH)(北京索萊寶,中國),脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation,LPO)(武漢伊萊瑞特,中國),Fe2+比色法檢測試劑盒(廣州沛瑜,中國),熒光素酶報告載體野生型(wild type,WT)-SLC7A11、突變型(mutant type,MT)-SLC7A11、WT-BTRC、MT-BTRC由上海吉瑪基因公司構(gòu)建。0.45 μm過濾膜(Millipore,美國),多功能酶標(biāo)分析儀(匯松,中國),電泳儀(六一,中國),SCL7A11多克隆抗體(SAB#43437,美國),BTRC多克隆抗體(SAB#32369,美國),TFRC多克隆抗體(SAB#33101,美國),泛素化Ubiquitin多克隆抗體(武漢三鷹#10201-2-AP,中國),β-actin單克隆內(nèi)參抗體(abcam#ab8226,美國),hsa-miR-199-3p模擬物(5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′)、hsa-miR-199-3p抑制物(5′-UAACCAAUGUGCAGACUACUGU-3′)、hsa-miR-199-5p模擬物(5′-CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC-3′)、hsa-miR-199-5p抑制物(5′-GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG-3′)(上海吉瑪基因,中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染miR-199模擬物和抑制物

將細(xì)胞1×105個/mL接種于培養(yǎng)瓶中,加入10%血清的DMEM培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后,0.25%胰蛋白酶消化2～3 min,PBS洗滌細(xì)胞2次,再傳代培養(yǎng)。加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。胰腺癌細(xì)胞Panc-1和BxPC3實驗分為對照組、miR-199-3p/5p模擬物組、miR-199-3p/5p抑制物組。

1.3 qRT-PCR檢測miR-199-3p/5p的表達(dá)水平

收集細(xì)胞,用300 μL TRIzol裂解液提取總RNA。加入氯仿12 000 g,10 min低溫離心。取氯仿層加入等量的異丙醇過夜沉淀。10 min低溫離心,去除上清,用優(yōu)級乙醇清洗沉淀。晾干后復(fù)溶,紫外分光光度計Nanodrop One檢測總RNA的含量和純度;按照High-Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;依據(jù)SYBR Green試劑盒的說明書進(jìn)行PCR擴增,以U6為內(nèi)參,檢測各樣本中基因的表達(dá)水平,通過2-ΔΔCT方法計算各基因的相對含量。hsa-miR-199-3p上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGACAGTAGTCTGCACAT-3′,下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAACCAAT-3′;hsa-miR-199-5p上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTTAGACTAT-3′,下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAACAGAT-3′;U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 Western blotting檢測蛋白水平

收集細(xì)胞,加入500 μL RIPA蛋白裂解液,12 000 g離心8 min,取上清液,用BCA蛋白試劑盒對樣品中總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。加入適量蛋白上樣緩沖液,放置于100 ℃干式恒溫儀加熱8 min,使蛋白充分變性,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿\用SDS-PAGE凝膠電泳方法分離蛋白質(zhì)樣品,將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,4 ℃過夜孵育一抗,用辣根過氧化物酶標(biāo)記法檢測SLCTA11、BTRC、TFRC蛋白質(zhì)表達(dá)水平。掃描后應(yīng)用ImageJ軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.5 試劑盒檢測胰腺癌細(xì)胞中GSH、Fe2+、LPO水平

收集細(xì)胞,加入裂解液裂解細(xì)胞,離心取上清備用。分別參照GSH、Fe2+、LPO檢測試劑盒說明書進(jìn)行樣品溶液的配制及檢測。

1.6 免疫共沉淀檢測BTRC對TFRC泛素化的調(diào)節(jié)

在Panc-1和BxPC3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)的BTRC(OE-BTRC組:NM_033637.4→Homo sapiens,Gene ID:8945,CDS:17—1834,1818 bp)和敲除的BTRC(KD-BTRC組,siRNA:5′-CCCAGGGACUGGCGCACUCdTdT-3′),對照組細(xì)胞不做任何處理。48 h后收集細(xì)胞,加入適量含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液,冰上裂解30 min,離心30 min后取上清;加入1 μg相應(yīng)的TFRC抗體,緩慢搖晃后4 ℃孵育過夜。取10 μL蛋白A瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3次,每次3 000 r/min離心3 min預(yù)處理,加入到和TFRC抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中,緩慢搖晃后4 ℃孵育4 h,使TFRC抗體與蛋白A瓊脂糖珠偶連。免疫沉淀IP反應(yīng)后,在4 ℃環(huán)境下以3 000 r/min離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液洗4次后進(jìn)行Western blotting相關(guān)檢測(同時設(shè)置Input陽性對照組,即用IP前的樣品做Western blotting排除假陽性干擾)。

1.7 熒光素酶活性檢測miR-199-3p/5p與靶基因的相互作用

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后加入細(xì)胞裂解液,室溫下裂解15 min,移液槍反復(fù)吹打,吸取裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中,14 000 g離心15 min,取上清。小心吸取20 μL細(xì)胞裂解上清(用細(xì)胞裂解液補至100 μL),與10 μL熒光素酶檢測工作液迅速混勻,使用酶標(biāo)儀檢測雙熒光素酶報告基因活性。

PAAD細(xì)胞Panc-1、BxPC3分為陰性對照組(WT/MT空報告質(zhì)粒)、miR-199-3p/5p模擬物+WT/MT組(WT/MT SLC7A11-3UTR熒光素酶報告質(zhì)粒或WT/MT BTRC-3UTR熒光素酶報告質(zhì)粒,miR-199-3p模擬物對應(yīng)加入SLC7A11-3UTR,miR-199-5p模擬物對應(yīng)加入BTRC-3UTR)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料采用方差分析,計量資料采用t檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 miR-199-3p/5p在胰腺癌Panc-1和BxPC3細(xì)胞中的表達(dá)水平

與對照組比較,miR-199-3p/5p模擬物組miR-199-3p和miR-199-5p的基因表達(dá)水平均顯著上調(diào),抑制物組顯著降低(P<0.05;圖1),提示轉(zhuǎn)染成功。

圖1 miR-199-3p/5p在胰腺癌Panc-1和BxPC3細(xì)胞中的表達(dá)水平a為P<0.05,與對照組比較。

2.2 miR-199-3p/5p調(diào)控胰腺癌細(xì)胞鐵死亡GSH、Fe2+、LPO水平

與對照組比較,miR-199-3p/5p模擬物組GSH水平降低,Fe2+、LPO水平升高;抑制物組各指標(biāo)則相反(P<0.05;圖2)。

圖2 miR-199-3p/5p調(diào)控胰腺癌細(xì)胞鐵死亡相關(guān)GSH、Fe2+、LPO水平a為P<0.05,與對照組比較。

2.3 miR-199-3p/5p調(diào)控胰腺癌細(xì)胞鐵死亡相關(guān)信號通路SLC7A11、BTRC、TFRC蛋白水平

與對照組比較,miR-199-3p/5p模擬物組SLC7A11、BTRC蛋白水平降低,TFRC蛋白水平升高;miR-199-3p/5p抑制物組則相反(P<0.05;圖3)。

圖3 miR-199-3p/5p調(diào)控胰腺癌細(xì)胞鐵死亡相關(guān)信號通路SLC7A11、BTRC、TFRC蛋白水平a為P<0.05,與對照組比較。

2.4 BTRC調(diào)控TFRC泛素化水平

與對照組比較,Input中,OE-BTRC組BTRC蛋白水平顯著上調(diào),而KD-BTRC組BTRC蛋白水平顯著降低,提示質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染成功。OE-BTRC組顯著降低TFRC蛋白水平,而KD-BTRC組提高TFRC本身蛋白水平。TFRC抗體IP沉淀后Western blotting檢測Ubiquitin,OE-BTRC組能夠顯著降低TFRC蛋白泛素化水平,KD-BTRC組則提高TFRC蛋白泛素化水平(P<0.05;圖4)。

圖4 BTRC調(diào)控TFRC泛素化水平1為對照組;2為OE-BTRC組;3為KD-BTRC組。a為P<0.05,與對照組比較。

2.5 雙熒光素酶報告結(jié)果

miR-199-3p與SLC7A1靶向結(jié)合,miR-199-5p與BTRC靶向結(jié)合(P<0.05;圖5A)。與陰性對照組比較,miR-199-3p模擬物+WT-SLC7A11組熒光素酶活性明顯降低(P<0.05);miR-199-5p模擬物+WT-BTRC組熒光素酶活性明顯降低(P<0.05;圖5B)。

3 討 論

miRNA與特定靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)多個基因的表達(dá)[5-6]。目前,miR-199a已被證明能抑制多種腫瘤生長,包括食管癌、肝癌和結(jié)直腸癌[7-9]。然而,關(guān)于miR-199對胰腺癌的調(diào)控作用仍未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-199模擬物和抑制物結(jié)果表明,miR-199模擬物具有抗胰腺癌作用,其機制與誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡有關(guān)。另外,BTRC能調(diào)控TFRC的蛋白泛素化水平,抑制BTRC的表達(dá)能夠誘導(dǎo)TFRC的蛋白泛素化降解,提高TFRC本身蛋白水平。

迄今為止,報道的miR-199a下游靶基因包括癌基因PHLPP1、E2F3、FZD6/7、HK2和MAP3K11,在各種癌癥的發(fā)病機制中起作用[10]。SLC7A11是誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵蛋白[11]。SLC7A11和SLC3A2是胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體(System Xc-)的重要組成部分,其在腫瘤細(xì)胞系集中表達(dá),表明這些細(xì)胞中的System Xc-活性可能更高。Huang等[12]利用寡核苷酸芯片發(fā)現(xiàn),9株肺癌細(xì)胞株中,A549、HOP-62、NCI-H226、NCI-H322M和NCI-H460這5株細(xì)胞中SLC7A11呈高表達(dá);其中A549中SLC7A11和SLC3A2表達(dá)量最高。miR-199分為3p和5p,在本研究中,過表達(dá)miR-199-3p靶向抑制SLC7A11的表達(dá),可能進(jìn)一步通過抑制半胱氨酸轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞合成GSH,GSH是GPX4降解LPO的必需反應(yīng)底物,當(dāng)GSH合成通路受抑時,LPO積累,鐵死亡發(fā)生[13]。此外,miR-199-5p靶向抑制BTRC誘導(dǎo)TFRC的泛素化降解,從而提升細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平,促進(jìn)LPO在胰腺癌細(xì)胞中的堆積,誘發(fā)胰腺癌細(xì)胞鐵死亡。本實驗采用雙熒光素酶報告實驗驗證了miR-199與靶基因的相互作用。

綜上所述,本實驗首先用胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-199模擬物和抑制物,結(jié)合生信分子生物學(xué)預(yù)測證實,miR-199-3p靶向抑制胰腺癌細(xì)胞中SLC7A11,進(jìn)而降低GPX4表達(dá)和GSH水平;同時miR-199-5p靶向抑制胰腺癌細(xì)胞中BTRC,則能提高TFRC表達(dá)和Fe2+水平;兩條信號通路最終均可促進(jìn)LPO累積,誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。