張晶, 羅雯, 甘卓, 楊宇

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 1.醫(yī)務部,2.放射科,湖南長沙 410007;3.湖南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科,湖南長沙 410013;4.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科,湖南長沙 410007

甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer,ATC)具有惡性程度高、易轉移等特點[1]。侵襲和轉移是惡性腫瘤細胞的主要生物學特征,深入了解ATC腫瘤細胞的侵襲和遷移機制,尋找新的分子靶標,對診斷和治療ATC具有重要意義。鋅指E盒結合同源框1(zinc finger E-box-binding homeology box 1,ZEB1)參與調控腫瘤細胞的各種惡性行為,在甲狀腺癌組織及甲狀腺癌細胞中呈高表達狀態(tài),且可促進癌細胞的侵襲和遷移[2-3]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在細胞增殖、黏附、分化等多種生物學進程中發(fā)揮著重要作用[4],miR-23b已被證實可作為抑瘤因子參與肺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤的病理發(fā)展過程[5-6],但miR-23b-3p在ATC中的表達如何及其是否通過靶向調控ZEB1對ATC的發(fā)生和發(fā)展產生影響,目前未見報道。本研究擬探討miR-23b-3p與ZEB1的靶向關系以及對ATC FRO細胞侵襲和遷移的影響,為臨床ATC的治療提供潛在靶點。

1 材料和方法

1.1 ATC組織來源

取2017年8月—2020年2月于本院經確診的52例ATC患者的癌組織及其癌旁組織,臨床分期:Ⅰ期8例、Ⅱ期11例、Ⅲ期17例、Ⅳ期16例,其中男性27例,女性25例,年齡15～67歲,平均(41.4±12.1)歲,所有患者經病理組織學確診,均簽署知情同意書。

1.2 材料與儀器

甲狀腺未分化癌細胞FRO購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心;miR-23b-3p mimic及其陰性對照(miR-NC)由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成,miR-23b-3p mimic:5′-AUCACAUUGCCAGGGAUUACC-3′,miR-NC:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′;RPMI 1640培養(yǎng)基和FBS購自美國Gibco公司;LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司;反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;基質膠Matrigel購自美國BD公司;雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司;ZEB1、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9和GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;PCR擴增儀購自美國Thermo公司;凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉染及分組

人甲狀腺未分化癌細胞FRO復蘇后培養(yǎng)于含1%青霉素-鏈霉素溶液和10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2孵育,每2～3天傳代1次。取對數(shù)期生長細胞,接種于6孔板中,待細胞融合度達到80%時,按照LipofectamineTM 2000轉染試劑說明書進行轉染。細胞分為miR-23b-3p mimic組、miR-NC組和空白組,其中miR-23b-3p mimic組和miR-NC組分別轉染miR-23b-3p mimic和陰性對照48 h,空白組不做任何處理。qRT-PCR檢測細胞中miR-23b-3p表達水平。

1.4 qRT-PCR檢測miR-23b-3p和ZEB1 mRNA

收集癌組織、癌旁組織和各組細胞樣本,采用TRIzol法提取細胞總RNA,將RNA反轉錄為cDNA,然后以cDNA為模板,在熒光PCR擴增儀上進行mRNA擴增。引物序列:miR-23b-3p正向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTAATC-3′,反向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGGTGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′,反向引物為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′;ZEB1正向引物為5′-ACTGTTTGTAGCGACTGGATT-3′,反向引物為5′-TAAAGTGGCGGTAGATGGTA-3′;GAPDH正向引物為5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反應程序為:50 ℃反轉錄3 min,95 ℃預變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火并延伸,循環(huán)40次,以U6作為miR-23b-3p的內參,GAPDH作為ZEB1的內參,采用2-ΔΔCt法計算miR-23b-3p和ZEB1的mRNA相對表達水平。

1.5 體外三維培養(yǎng)觀察

將Matrigel鋪于預冷的24孔板中,400 μL/孔,37 ℃避光靜置30 min。收集各組細胞用胰蛋白酶消化成單細胞,接種于Matrigel上(1.5×105個/孔)培養(yǎng)24 h,共聚焦顯微鏡拍攝照片,高倍顯微鏡下隨機選取5個視野,分別計數(shù)細胞所形成的管腔數(shù)目,取每個視野均值即為細胞血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)形成能力。

1.6 Transwell法檢測細胞侵襲和遷移能力

將Matrigel膠置于4 ℃冰箱溶解,同時將實驗需要用到的試劑耗材全部放入冰箱預冷,防止膠過早凝固。按照說明書用無血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠(侵襲實驗需要提前在Transwell小室上層平鋪30 μL稀釋后的Matrigel膠,遷移實驗不需要加膠)。細胞轉染48 h后,胰酶消化細胞并計數(shù),用無血清的培養(yǎng)基重懸細胞,以1×105個/孔接種于上層,下層加入含20%血清的培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入多聚甲醛固定20 min,再采用0.1%結晶紫室溫染色30 min,PBS清洗小室3遍后,倒置顯微鏡下拍照,隨機選取5個視野,對每個視野內穿透小室微孔膜的細胞進行計數(shù)。

1.7 Western blotting檢測細胞中相關蛋白表達水平

收集各組細胞沉淀,用PBS沖洗細胞2～3次,于冰上充分裂解30 min,4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min,收集上清,采用BCA法測定蛋白水平。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后轉移至PVDF膜,將轉完的膜放入裝有TBST的孵育槽中,快速涮洗1次,加上脫脂牛奶,放置于脫色搖床上,室溫下封閉90 min,按照抗體說明書孵育一抗ZEB1、VEGF、MMP-2、MMP-9和GAPDH,配置好后,倒掉孵育槽中的封閉液,加入配置好的一抗,4 ℃孵育搖床過夜,次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h后顯色。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析,以GAPDH為內參計算各蛋白相對表達量。

1.8 熒光素酶報告實驗

TargetScan軟件預測miR-23b-3p和ZEB1是否存在結合位點,確認存在結合位點后構建ZEB1野生型(wild type,WT)和突變型(mutant type,MUT)熒光素酶報告基因質粒并轉染FRO細胞,同時轉染miR-23b-3p mimic或miR-NC,轉染48 h后按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書測定熒光素酶的相對活性。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 ATC組織及癌旁組織中miR-23b-3p、ZEB1 mRNA表達及其相關性

與癌旁組織比較,ATC組織miR-23b-3p表達水平顯著降低(P<0.01),ZEB1 mRNA水平顯著升高(P<0.01;圖1)。Pearson相關性分析結果顯示,ATC組織中的miR-23b-3p與ZEB1 mRNA呈負相關(r=-0.802,P<0.01)。

圖1 ATC組織及其癌旁組織中miR-23b-3p、ZEB1 mRNA的比較a為P<0.01,與癌旁組織比較。

2.2 過表達miR-23b-3p對FRO細胞ZEB1表達的影響

與空白組和miR-NC組比較,miR-23b-3p mimic組miR-23b-3p表達水平升高(P<0.01;圖2A),提示miR-23b-3p mimic轉染成功。與空白組和miR-NC組比較,miR-23b-3p mimic組ZEB1蛋白及mRNA表達水平顯著降低(P<0.01;圖2B)。

圖2 FRO細胞中miR-23b-3p和ZEB1表達水平的比較1為空白組;2為miR-NC組;3為miR-23b-3p mimic組。A為miR-23b-3p表達水平;B為ZEB1蛋白及mRNA相對表達水平。a為P<0.01,與空白組和miR-NC組比較。

2.3 過表達miR-23b-3p對FRO細胞VM形成能力的影響

空白組和miR-NC組的FRO細胞相互融合連接形成血管樣結構;與空白組和miR-NC組比較,miR-23b-3p mimic組細胞形成的管腔數(shù)目顯著減少(P<0.01;圖3),表明過表達miR-23b-3p可抑制FRO細胞的VM形成能力。

圖3 過表達miR-23b-3p對FRO細胞VM形成能力的影響A為FRO細胞VM結果鏡下圖(100×);B為各組VM數(shù)量柱狀圖。a為P<0.01,與空白組和miR-NC組比較。

2.4 過表達miR-23b-3p對FRO細胞侵襲、遷移的影響

與空白組和miR-NC組比較,miR-23b-3p mimic組侵襲和遷移細胞數(shù)目均顯著減少(P<0.01;圖4)。過表達miR-23b-3p可抑制FRO細胞侵襲和轉移。

圖4 過表達miR-23b-3p對FRO細胞侵襲和遷移能力的影響A為Transwell法檢測結果鏡下圖(結晶紫染色,200×);B為FRO細胞侵襲、遷移數(shù)柱狀圖。a為P<0.01,與空白組和miR-NC組比較。

2.5 過表達miR-23b-3p對FRO細胞VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

與空白組和miR-NC組比較,miR-23b-3p mimic組VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.01;圖5)。

圖5 miR-23b-3p對FRO細胞VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響1為空白組;2為miR-NC組;3為miR-23b-3p mimic組。a為P<0.01,與空白組和miR-NC組比較。

2.6 miR-23b-3p與ZEB1的靶向作用關系

結果顯示,miR-23b-3p在ZEB1基因3′-UTR區(qū)域存在靶向結合位點(圖6A)。雙熒光素酶報告基因結果顯示,miR-23b-3p mimic顯著降低野生型ZEB1熒光素酶活性(P<0.01;圖6B)。

圖6 miR-23b-3p與ZEB1的靶向關系A為TargetScan預測miR-23b-3p在ZEB1 3′-UTR區(qū)域的靶向結合位點;B為熒光素酶活性柱狀圖。a為P<0.01,與miR-NC組比較。

3 討 論

近年來,與疾病相關的miRNA已成為惡性腫瘤重要的治療靶點和診斷依據[7-9]。研究報道,ZEB1能促進癌細胞侵襲和遷移,且在甲狀腺癌組織中高表達[8-10]。在ATC的發(fā)生發(fā)展中,miR-23b-3p與ZEB1具有靶向調控關系還未得到證實。本研究結果顯示,miR-23b-3p可以通過靶向下調ZEB1表達調控ATC細胞FRO的侵襲和轉移能力。

本研究結果顯示,miR-23b-3p在ATC組織中的表達顯著低于癌旁組織,而ZEB1在ATC組織中的表達顯著高于癌旁組織。轉染miR-23b-3p mimic后,FRO細胞的侵襲和轉移能力顯著降低,該結果與Yan等[6]的實驗結果相一致。本研究結果顯示,過表達miR-23b-3p能夠顯著抑制FRO細胞的VM形成,進一步明確miR-23b-3p參與了FRO細胞的侵襲、轉移過程。

腫瘤間質中存在著大量的微血管,直接影響著腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移,腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血管的生成[10-12]。VEGF和MMP是公認的VM形成的信號轉導樞紐分子,與腫瘤細胞通過VEGF塑形和MMP介導的細胞外基質重塑密切相關[13-15]。本研究結果顯示,過表達miR-23b-3p能夠顯著抑制FRO細胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達,初步證實過表達miR-23b-3p抑制FRO細胞VM形成,其可能作用機制是通過下調VEGF和MMP-2、MMP-9表達實現(xiàn)的。為進一步明確miR-23b-3p和ZEB1在FRO細胞VM形成中的靶向作用關系,本研究在FRO細胞中過表達miR-23b-3p后,檢測了細胞中ZEB1的表達水平,研究結果顯示,細胞中ZEB1 mRNA水平和蛋白表達水平顯著下降,隨后通過生物信息預測發(fā)現(xiàn),miR-23b-3p基因序列上存在ZEB1的結合位點,進一步通過熒光素酶報告實驗證實ZEB1是miR-23b-3p的靶基因。

綜上所述,過表達miR-23b-3p可能通過靶向下調ZEB1表達抑制FRO細胞的VM形成,從而抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。本研究可為ATC的靶向治療提供思路和實驗數(shù)據參考。