石晟源, 肖雙, 胡澤慧, 龍鼎新

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 典型環(huán)境污染與健康危害湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南衡陽 421001

三鄰甲苯基磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)為一種有機(jī)磷酸酯類化合物,由于其暴露途徑多、毒性高及人類對其毒性作用認(rèn)識不足,TOCP中毒事件在世界各地均有報(bào)道[1]。研究發(fā)現(xiàn),自噬在TOCP誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性、生殖毒性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2],但確切作用機(jī)制并未完善。鈣蛋白酶系統(tǒng)主要由μ-鈣蛋白酶、m-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制素構(gòu)成。μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶都是鈣依賴性蛋白酶,均可被Calpastatin特異性抑制[3]。45Ca吸收試驗(yàn)表明,TOCP增加了母雞腦突觸體對鈣的攝取[4],鈣通道阻滯劑維拉帕米(Verapamil)可消除TOCP增強(qiáng)的細(xì)胞器蛋白的磷酸化[5],而暴露于TOCP的母雞大腦表現(xiàn)出細(xì)胞溶質(zhì)鈣濃度水平升高[6]。動(dòng)物模型也證明,TOCP可激活鈣蛋白酶[7],線粒體自噬也與鈣蛋白酶相關(guān)[8]。因此,鈣蛋白酶可能與TOCP誘導(dǎo)的自噬機(jī)制相關(guān)。與未分化細(xì)胞相比,分化的SK-N-SH細(xì)胞的tau、MAP、神經(jīng)絲蛋白表達(dá)顯著增加[9-10],本研究以未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象,探討鈣蛋白酶對TOCP誘導(dǎo)的自噬的調(diào)節(jié)作用,為揭示TOCP誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系來自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所(中國,北京)。DMEM培養(yǎng)基、全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)、鈣蛋白酶抑制肽ac184-210(Calpastatin)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、TritonX-100、鹽酸維拉帕米(Verapamil Hydrochloride)、TOCP、兔抗LC3多克隆抗體(L8918)、小鼠抗Beclin1單克隆抗體、小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購自Sigma公司(美國,圣路易斯)。熒光鈣蛋白酶底物Suc-LLVY-AMC(P-802)購自Enzolifesciences公司(瑞士,勞森)。2-APB購自阿拉丁公司(中國,上海)。HRP偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG(H+L)購自ZSGB-BIO公司(中國,北京)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分化

SH-SY5Y細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM中培養(yǎng),37 ℃、5%CO2飽和濕度下孵育,每2天更換培養(yǎng)基,每3～4天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)皿用錫箔紙包裹,用含10 μmol/L ATRA的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化6天,使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞。如果細(xì)胞出現(xiàn)至少1個(gè)比細(xì)胞體長的突起,則認(rèn)為細(xì)胞已分化,可被視為神經(jīng)突。倒置顯微鏡隨機(jī)選擇視野測量至少100個(gè)細(xì)胞最長神經(jīng)突的長度。

1.3 細(xì)胞處理和分組

分化和未分化的SH-SY5Y細(xì)胞用0～1.0 mmol/L TOCP處理12～48 h,用磷酸鹽緩沖鹽水(137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、pH7.4)洗滌2次。分化和未分化細(xì)胞用20 μmol/L Verapamil或100 μmol/L 2-APB或20 μmol/L Verapamil+100 μmol/L 2-APB預(yù)處理15 min,然后用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。分化和未分化細(xì)胞用1.0 mmol/L 3-MA預(yù)處理4 h或用500 nmol/L Calpastatin預(yù)處理6 h,然后用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。Calpastatin和3-MA在使用前30 min溶解在DMEM中,其他試劑用DMSO溶解,細(xì)胞用0.4%DMSO處理作為對照組。

1.4 熒光分光光度法檢測鈣蛋白酶活性

先用20 μmol/L Verapamil或100 μmol/L 2-APB預(yù)處理15 min,然后用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。然后,用含有1 mmol/L Na3VO4的冰冷PBS洗滌細(xì)胞2次,并在含有50 mmol/L HEPES(pH7.6)、150 mmol/L NaCl、1%TritonX-100、10 mmol/L 2-巰基乙醇、0.1 mmol/L PMSF和10 mg/L亮肽素的緩沖液中裂解30 min,4 ℃ 12 000 g/min離心15 min,留上清液,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,將等體積的裂解物與50 μmol/L鈣蛋白酶底物Suc-LLVY-AMC在Hanks平衡鹽溶液中稀釋至200 μL,并在37 ℃下孵育15 min。加入100 μL 0.4 mol/L HCl終止反應(yīng),熒光分光光度計(jì)RF5301(日本島津公司)在380 nm和460 nm的激發(fā)和發(fā)射波長下測量熒光。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白含量。為了計(jì)算相對鈣蛋白酶活性,將熒光增加率除以蛋白質(zhì)濃度并歸一化為基礎(chǔ)活性。

1.5 Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞以1×107個(gè)/90 mm培養(yǎng)皿接種,在不存在或存在20 μmol/L Verapamil、100 μmol/L 2-APB、1.0 mmol/L 3-MA和500 nmol/L Calpastatin的情況下,用1.0 mmol/L TOCP處理48 h。Western blotting檢測細(xì)胞LC3和Beclin1水平。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次,制備細(xì)胞提取物,在緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、1% TritonX-100、0.1%SDS、1%去氧膽酸鈉、1 mmol/L EDTA和1 mmol/L PMSF、pH7.4)中裂解30 min。將裂解物以14 000 g/min離心10 min,并使用BCA法測定蛋白含量。將裂解物(80 μg總蛋白)在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)移至Hybond ECL硝化纖維素膜并用一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。洗膜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)孵育。使用標(biāo)準(zhǔn)ECL方法檢測蛋白質(zhì)印跡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞

用含有10 μmol/L ATRA的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化3天,觀察到SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象(圖1)。

圖1 顯微鏡觀察SH-SY5Y細(xì)胞(100×)

2.2 TOCP增加未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中鈣蛋白酶活性

未分化SH-SY5Y細(xì)胞在1.0 mmol/L TOCP處理24 h后,鈣蛋白酶活性開始顯著增加,分化細(xì)胞12 h后鈣蛋白酶活性即開始顯著增加;未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞鈣蛋白酶活性均表現(xiàn)為濃度依賴性和時(shí)間依賴性增加(P<0.05,P<0.01;圖2)。

圖2 TOCP上調(diào)未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞鈣蛋白酶活性a為P<0.05,b為P<0.01,與對照組比較。n=3。

2.3 鈣蛋白酶抑制劑緩解TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬

透射電鏡下,1.0 mmol/L TOCP處理48 h的SH-SY5Y細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯自噬泡的形成,呈現(xiàn)聚集的空泡或液泡(藍(lán)色箭頭),提示TOCP確實(shí)能夠誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞自噬的發(fā)生(圖3A)。實(shí)驗(yàn)濃度下鈣蛋白酶抑制劑并不影響未分化和分化SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)(圖3B)。1.0 mmol/L TOCP處理48 h后,未分化、分化的SH-SY5Y細(xì)胞LC3-II和Beclin1表達(dá)增加(P<0.01);Calpastatin可以部分降低TOCP在未分化、分化的SH-SY5Y細(xì)胞中誘導(dǎo)的LC3-II和Beclin1的表達(dá)(P<0.05,P<0.01;圖3C和D);表明TOCP誘導(dǎo)的自噬受鈣蛋白酶激活的調(diào)節(jié)。

圖3 鈣蛋白酶抑制劑緩解TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬A為SH-SY5Y細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(8 000×),藍(lán)色箭頭為自噬泡;B為鈣蛋白酶抑制劑對SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響(100×);C和D分別為未分化和分化SH-SY5Y細(xì)胞LC3-II、Beclin1的表達(dá)。a為P<0.05,b為P<0.01,與DMSO組比較;c為P<0.05,d為P<0.01,與TOCP組比較。n=3。

2.4 鈣通道阻滯劑在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中抑制鈣蛋白酶活性

與TOCP組比較,Verapamil和2-APB處理后,未分化和分化的SH-5Y5Y細(xì)胞均觀察到鈣蛋白酶活性顯著降低(P<0.01;圖4)。但Verapamil+2-APB+TOCP組并沒有較Verapamil+TOCP組和2-APB+TOCP組進(jìn)一步降低(圖4)。這些結(jié)果表明,TOCP通過外部鈣流入和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子等鈣紊亂激活鈣蛋白酶活性。

圖4 鈣通道阻滯劑抑制TOCP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞鈣蛋白酶活性上調(diào)a為P<0.05,b為P<0.01,與DMSO組比較;c為P<0.05,d為P<0.01,與TOCP組比較。n=3。

2.5 鈣通道阻滯劑調(diào)節(jié)TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬

圖5A為鈣通道阻滯劑作用下分化和未分化SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)。在Verapamil預(yù)處理的未分化和分化SH-SY5Y細(xì)胞中,TOCP誘導(dǎo)的LC3-II表達(dá)完全抑制(P<0.01)。然而,2-APB并未降低TOCP誘導(dǎo)的LC3-II水平,未分化SH-SY5Y細(xì)胞的LC3-II表達(dá)與TOCP組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相反,在分化的SH-SY5Y細(xì)胞中,與TOCP組相比,LC3-II表達(dá)被2-APB顯著上調(diào)(P<0.01);在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中,Verapamil+2-APB+TOCP組顯示出部分抑制作用(P<0.05;圖5)。以上表明TOCP誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可能與細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂導(dǎo)致鈣蛋白酶激活相關(guān)。

圖5 鈣通道阻滯劑調(diào)節(jié)TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬A為鈣通道阻滯劑作用下SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)(100×);B和C分別為未分化和分化SH-SY5Y細(xì)胞LC3-II的表達(dá)。a為P<0.05,b為P<0.01,與DMSO組比較;c為P<0.05,d為P<0.01,與TOCP組比較。n=3。

3 討 論

TOCP在工業(yè)上應(yīng)用廣泛,由于人們對其認(rèn)識不足,TOCP中毒事件常有報(bào)道。TOCP的毒作用機(jī)制至今未能完全闡明,近年來,自噬機(jī)制作為研究熱點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TOCP可增加分化和未分化SH-SY5Y細(xì)胞的自噬活性[12-13],但TOCP如何誘導(dǎo)自噬的詳細(xì)機(jī)制仍未闡明。細(xì)胞在分化過程中形態(tài)和功能將出現(xiàn)一定的變化。本研究發(fā)現(xiàn),TOCP處理導(dǎo)致鈣蛋白酶呈濃度和時(shí)間依賴性激活,分化細(xì)胞比未分化細(xì)胞對TOCP的處理更敏感,提前出現(xiàn)鈣蛋白酶升高,但在整體趨勢上并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

鈣蛋白酶在細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架重塑、自噬、細(xì)胞凋亡等生理過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[3],在異丙酚通過d-天冬氨酸受體抑制腫瘤壞死因子-α介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元自噬機(jī)制中,m-鈣蛋白酶發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。自噬過程的發(fā)生主要包括自噬信號誘導(dǎo)、囊泡成核、自噬體延長封閉、自噬體與溶酶體融合并對底物進(jìn)行降解[15],吞噬細(xì)胞膜擴(kuò)張和ATG5與鈣蛋白酶切割相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn),抑制鈣蛋白酶可恢復(fù)自噬活性并防止線粒體斷裂[17],鈣蛋白酶通過促進(jìn)感染后的自噬調(diào)節(jié)CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎[18],鈣蛋白酶6在炎癥環(huán)境中也能抑制自噬[19],而缺血誘導(dǎo)的鈣蛋白酶1激活會損害溶酶體功能并抑制自噬體形成[20]。在神經(jīng)退行性疾病的治療中,鈣蛋白酶抑制劑將受到重視[21],Calpain-1 C2L結(jié)構(gòu)域肽已發(fā)揮抗氧化作用[22]。然而導(dǎo)致鈣蛋白酶活性變化的原因眾多,內(nèi)源性蛋白Calpastatin作為Calpain 1和2的特異性抑制劑,已在研究中廣泛使用。3-MA是一種特異性自噬抑制劑,通過Ⅲ類PI3K通路抑制自噬體的形成,可顯著抑制TOCP誘導(dǎo)的LC3-II和Beclin1的表達(dá)。本研究中,3-MA處理作為抑制自噬的陽性對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑Calpastatin可以抑制未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中TOCP誘導(dǎo)的自噬水平,提示TOCP可以在未分化和分化的SH-SY5Y細(xì)胞中通過影響鈣蛋白酶活性而調(diào)節(jié)自噬。

同樣,由于鈣蛋白酶是鈣依耐性的,鈣蛋白酶活性增加可能是鈣水平升高和鈣蛋白酶抑制素豐度降低的結(jié)果[23],細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)將直接影響鈣蛋白酶的活性。而TOCP會擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣含量,鈣可以通過胞外流入細(xì)胞質(zhì)。T型和L型鈣通道是質(zhì)膜上電壓門控鈣通道,Verapamil通過抑制T型和L型鈣通道保護(hù)細(xì)胞器蛋白免受TOCP誘導(dǎo)的磷酸化[5]。鈣也可以由內(nèi)部鈣儲存庫釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),即可通過蘭尼堿受體和肌醇三磷酸(inositol triphosphate 3,IP3)受體激活而引起內(nèi)鈣釋放增加。蘭尼堿受體鈣通道在心肌和骨骼肌中占主導(dǎo)地位,IP3受體不斷介導(dǎo)鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放,而2-APB是一種IP3受體拮抗劑。研究發(fā)現(xiàn),Piezo1介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣過載,從而導(dǎo)致鈣蛋白酶的激活[24]。本實(shí)驗(yàn)通過維拉帕米和2-APB阻斷鈣通道后發(fā)現(xiàn),SH-SY5Y細(xì)胞鈣蛋白酶活性受到抑制。鈣是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要一環(huán)。據(jù)報(bào)道,鈣信號可以調(diào)節(jié)自噬[25-27]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的減少會激活鈣釋放激活鈣(Ca2+release activated Ca2+,CRAC)通道,導(dǎo)致胞外Ca2+內(nèi)流,高濃度2-APB通過抑制CARC電流限制胞質(zhì)鈣離子補(bǔ)充。當(dāng)同時(shí)用Verapamil和2-APB預(yù)處理時(shí),鈣蛋白酶活性未出現(xiàn)進(jìn)一步下降,可能是由于在Verapamil和2-APB分別處理時(shí),鈣蛋白酶活性已降至最低。上述結(jié)果表明,外部鈣流入和內(nèi)部鈣儲存釋放所導(dǎo)致的胞質(zhì)內(nèi)鈣含量升高是TOCP誘導(dǎo)鈣蛋白酶激活的原因之一。自噬相關(guān)蛋白LC3-II的檢測結(jié)果提示,Verapamil可以抑制TOCP誘導(dǎo)的自噬。因此,鈣蛋白酶調(diào)節(jié)由TOCP誘導(dǎo)的自噬可歸因于通過電壓門控鈣通道的外部鈣流入。然而,2-APB在分化的SH-SY5Y細(xì)胞中增加了TOCP的自噬水平,可能是由于2-APB不是特異性IP3受體抑制劑,還能通過影響鈣庫操作的鈣通道和SERCA泵調(diào)節(jié)自噬。

綜上,TOCP通過調(diào)節(jié)電壓門控鈣通道和IP3受體鈣通道上調(diào)鈣蛋白酶活性,進(jìn)而導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞自噬。