路曉 武景琦 張帆 韓易航 牟建青 梁賢 王蕓 曹兵 于可響 宋敏訓

摘 要：從山東濰坊地區(qū)以包涵體肝炎為病變特征的發(fā)病蛋雞中采集病料，通過接種7日齡SPF雞胚分離到1株病毒，經(jīng)PCR檢測、測序分析、進化樹分析和血清中和試驗鑒定，確定為血清8b型禽腺病毒。將該病毒通過肌肉注射接種14日齡SPF雞，結(jié)果僅部分試驗雞出現(xiàn)肝臟輕微壞死變性，這與臨床中發(fā)病雞肝臟明顯壞死甚至破裂并不相符，分析可能與飼養(yǎng)條件、管理水平、雞的品種和日齡、藥物使用等方面有關(guān)。

關(guān)鍵詞：蛋雞；血清8b型禽腺病毒；包涵體肝炎；分離鑒定

中圖分類號：S858.312.65文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2023）03-0001-05

雞包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis in chicken，IBH）是由Ⅰ群禽腺病毒引起雞的急性傳染病，是我國養(yǎng)雞業(yè)中的一種常見病和多發(fā)病。根據(jù)抗原性差異，Ⅰ群禽腺病毒可分為12個血清型，能引起包涵體肝炎、心包積液、肌胃糜爛等病變[1-3]。其中，血清4型（FAdV-4）病毒主要引起心包積液-肝炎綜合征，血清8a型（FAdV-8a）、8b型（FAdV-8b）和11型（FAdV-11）病毒僅導致包涵體肝炎，無心包積液現(xiàn)象[4-7]。雞包涵體肝炎多發(fā)于2～5周齡的雞群，主要癥狀是雞群死亡率突然增加，發(fā)病率可達到10%～20%，但死亡率較低，一般不超過5%，通常發(fā)病后5～7 d又恢復正常?；疾‰u主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、嗜睡、雞冠發(fā)白、羽毛雜亂等癥狀，剖檢可見以肝臟發(fā)黃變脆、腫大出血等為主要病變特征的包涵體肝炎，較少出現(xiàn)心包積液，部分腎臟腫大，呈淡黃色，脾臟也伴有腫大，骨髓呈淡紅色至淡黃色，最顯著的病理變化是肝細胞核內(nèi)有包涵體[8-9]。近幾年來該病在我國雞群中流行有上升的趨勢。

本研究于2022年從山東濰坊地區(qū)28周齡有包涵體肝炎病變的產(chǎn)蛋雞中分離到一株病毒，通過PCR檢測、測序分析、進化樹分析和血清中和試驗鑒定為血清8b型禽腺病毒，通過回歸試驗確定該病毒為致病病原。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況

山東濰坊地區(qū)一家規(guī)模化蛋雞養(yǎng)殖場，28周齡產(chǎn)蛋雞出現(xiàn)采食下降，死淘率上升，產(chǎn)蛋下降等癥狀。剖檢死亡雞發(fā)現(xiàn)，肝臟壞死變性、部分破裂，膽囊腫大，取病變肝臟用于病原分離。

1.2 材料和試劑

SPF雞胚和SPF雞購自山東昊泰動物繁育有限公司。

血清1型、4型、8a型、8b型和11型禽腺病毒陽性血清由本實驗室制備和保存。

DNA/RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自AXYGEN公司；一步法RT-PCR試劑盒、PCR Mix、pMD18-T載體、受感態(tài)細胞DH5ɑ購自北京全式金公司。

1.3 病料檢測

按照常規(guī)方法提取肝臟病料的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法進行Ⅰ群禽腺病毒病（FA）、禽流感（AI）、新城疫（ND）、傳染性支氣管炎（IB）、傳染性法氏囊炎（IBD）、傳染性喉氣管炎（ILT）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖癥（RE）、禽白血?。ˋL）、傳染性貧血?。–IA）等9種常見病毒病的檢測。

1.4 病毒分離

取發(fā)病雞的肝臟，加入5倍體積生理鹽水和終濃度1 000 U/mL的卡那霉素，剪碎后充分研磨，然后反復凍融2次，8 000 g離心10 min，取上清用0.22 μm濾器過濾除菌，菌檢無菌后經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，共6枚。收集接種后3～8 d死亡雞胚，觀察死胚的病變情況，并將尿囊液和胚體混合處理，標記為WF22。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 PCR擴增與測序鑒定 按照常規(guī)方法提取病毒的DNA，利用PCR方法對Ⅰ群禽腺病毒進行檢測。引物參照GenBank發(fā)表的Ⅰ群禽腺病毒保守序列進行設(shè)計，序列如下：P1：5'? CAARTTCA?GRCAGACGGT? 3'；P2：5'? GGCTTGACGTACGC TCCGTA? 3'，預期擴增片段大小約550 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青島）合成。取5 ?L擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖中電泳進行檢驗。按照DNA凝膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5ɑ。挑單菌落擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，鑒定為陽性的菌落送北京擎科生物科技有限公司（青島）進行測序。

1.5.2 Hexon基因測序分析 根據(jù)GenBank發(fā)表的血清8b型禽腺病毒主要抗原Hexon基因序列設(shè)計擴增引物，序列如下：P3：5'? CGCCGCATGTG CTACTAG? 3'；P4：5'? GGTGAGGATCGAGGAAC C? 3'，預期擴增片段大小約3 138 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司（青島）合成。提取病毒的DNA，利用上述引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物回收后送北京擎科生物科技有限公司（青島）進行測序。利用MEGA軟件與GenBank中不同血清型Ⅰ群禽腺病毒的Hexon基因序列進行比對，并繪制進化樹。

1.5.3 血清型鑒定 按照常規(guī)血清中和試驗方法[7]，利用血清1型、4型、8a型、8b型和11型禽腺病毒陽性血清對分離到的病毒進行血清型鑒定。

1.6 SPF雞回歸試驗

將WF22株病毒原液采用腿部肌肉注射的方式接種14日齡SPF雞10只，0.2 mL/只，同時設(shè)對照組5只，每只注射生理鹽水0.2 mL，觀察并記錄試驗雞發(fā)病、死亡與病變情況，攻毒后第7天剖殺所有試驗雞，觀察內(nèi)臟病變。

采集試驗雞有病變的肝臟，處理后接種7日齡SPF雞胚5枚，觀察雞胚死亡及病變情況，以確定是否能從實驗雞體內(nèi)再次分離到病毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料檢測

對收集的肝臟病料進行9種雞常見病毒病的檢測，結(jié)果顯示，只有Ⅰ群禽腺病毒為陽性，其它8種病毒均為陰性（圖1）。

2.2 病毒分離

將肝臟病料處理后接種7日齡SPF雞胚，雞胚大多在接種后5～8 d內(nèi)死亡，胚體通身出血，胚肝有黃白色壞死灶（圖2）。

2.3 病毒鑒定

2.3.1 PCR擴增與測序鑒定 利用Ⅰ群禽腺病毒通用引物對雞胚分離毒進行PCR檢測，結(jié)果為陽性。將擴增產(chǎn)物克隆后進行測序，通過比對發(fā)現(xiàn)，該序列與血清8b型禽腺病毒基因同源性最高，在99.9％以上。

2.3.2 Hexon基因測序分析 利用設(shè)計好的引物對WF22株的Hexon基因進行擴增測序，利用MEGA軟件將其與GenBank登錄的Ⅰ群禽腺病毒的Hexon基因序列進行比對，并繪制了進化樹（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WF22株與血清8b型禽腺病毒的遺傳關(guān)系最近。

2.3.3 血清型鑒定 利用血清1型、4型、8a型、8b型和11型禽腺病毒陽性血清對WF22分離株進行血清型鑒定，結(jié)果表明該分離株能被8b型陽性血清完全中和，被8a型陽性血清部分中和，不能被1型、4型和11型陽性血清中和。

2.4 SPF雞回歸試驗

將WF22株病毒接種14日齡SPF雞，攻毒后7 d內(nèi)試驗雞未出現(xiàn)明顯癥狀，飲水采食基本正常，第7天剖殺所有試驗雞，結(jié)果顯示，攻毒組4/10出現(xiàn)肝臟腫脹、輕微出血壞死等病變（圖4），其它組織無病變，而對照組雞肝臟均無病變。

取有病變的肝臟處理后接種SPF雞胚，結(jié)果有4枚雞胚在8 d內(nèi)死亡，死亡雞胚均出現(xiàn)胚體出血，病變與病毒初次分離時一致，說明能從回歸的試驗雞體內(nèi)重新分離到病毒。

3 討論

近十多年來，雞包涵體肝炎在山東地區(qū)一直呈散發(fā)性流行[10]，該病病程較短，死亡率一般不會超過5%，由Ⅰ群血清2型、8a型、8b型和11型禽腺病毒引起，主要發(fā)生在快大型肉雞，817肉雞、蛋雞、麻雞等發(fā)病較少。自2015年開始，我國大部分養(yǎng)雞地區(qū)發(fā)生了一種死亡快、死亡率高、以心包積液和肝臟腫大、質(zhì)脆、出血或壞死為主要剖檢病變特征的傳染病，稱為肝炎-心包積液綜合征，又稱安卡拉?。辉摬∷劳雎士蛇_50%以上，是由Ⅰ群血清4型禽腺病毒引起，各品種的雞均可發(fā)病。雞包涵體肝炎和肝炎-心包積液綜合征，這兩種疾病在血清型、死亡率、病變特征、流行特點等方面存在較大的差別[11-13]。

本研究從山東濰坊地區(qū)產(chǎn)蛋下降的蛋雞中分離到一株病毒，該病毒通過卵黃囊接種SPF雞胚，引起胚體出血，通過PCR檢測、測序分析、進化樹分析和血清中和試驗鑒定為血清8b型禽腺病毒。將該病毒回歸SPF雞，試驗雞未出現(xiàn)明顯癥狀，部分雞肝臟僅出現(xiàn)輕微腫脹、出血、壞死，這與臨床中發(fā)病雞采食下降、產(chǎn)蛋下降、羽毛雜亂、肝臟明顯壞死甚至破裂并不相符，分析可能與飼養(yǎng)條件、管理水平、雞的品種和日齡、藥物使用等方面有關(guān)。

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Isolation and Identification of a Serotype 8b Avian Adenovirus from Laying Chicken

LU Xiao1，2， WU Jingqi1，3， ZHANG Fan4， HAN Yihang4， MU Jianqing5， LIANG Xian5， WANG Yun6，

CAO Bing7，YU Kexiang1， SONG Minxun1

（（1. Institute of Poultry， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan? 250100， China;

2. College of Veterinary Medicine， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot? 010018， China;

3. Shandong Agricultural University ， Taian? 271018， China;

4. Yantai Aishijin Animal Health Products Co.， Ltd.， Yantai? 264003， China;

5. Shandong Delino Bioengineering Co.， Ltd.， Zibo? 256400， China;

6. Liaocheng Academy of Agricultural Sciences， Liaocheng? 252000， China;

7.Tengzhou Animal Husbandry and Fisheries Development Centre， Tengzhou? 275000， China）

Abstract：The diseased materials were collected from laying chicken with inclusion body hepatitis as the pathological feature in Weifang， Shandong Province. A virus strain was isolated from 7-day-old SPF chicken embryos，and identified as serum 8b avian adenovirus by PCR detection， sequencing analysis， evolutionary tree analysis and serum neutralization test. The virus was inoculated into 14-day-old SPF chickens by intramuscular injection.The results showed that only some of the experimental chickens had slight liver necrosis and degeneration， which was not consistent with the obvious liver necrosis or even rupture of the diseased chicken in clinical practice. This may be related to the feeding conditions， management level， chicken breeds and age， and drug use.

Keywords：Laying chicken Serotype 8b avian adenovirus;Inclusion body hepatitis;Isolation and identification