李雨陽 朱曉蓉 劉 婧 鄭曉敏 楊金奎,4* 楊芳遠,4*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100730;2. 北京市海淀醫(yī)院感染性疾病科,北京 100080;3. 清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100022;4. 北京市糖尿病研究所,北京 100730)

糖尿病腎病(diabetes kidney disease,DKD)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一,可導(dǎo)致終末期腎病,是糖尿病患者的重要死亡原因之一。在中國人群中,DKD已經(jīng)比腎小球腎炎相關(guān)慢性腎病更為常見[1]。除糖尿病病程、血糖、血壓等危險因素外,遺傳因素在DKD發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。觸珠蛋白(haptoglobin,Hp)是一種急性期反應(yīng)蛋白,其抗氧化應(yīng)激和促新生血管作用與DKD的發(fā)展息息相關(guān)[2]。人體的Hp有Hp1、Hp2 2種等位基因,組合形成Hp1-1、Hp2-1、Hp2-2 3種不同的基因型。Hp基因多態(tài)性于1955年通過淀粉凝膠電泳法首次被鑒定[3]。近年來,通過對DKD新型診斷標(biāo)志物的探索發(fā)現(xiàn),體內(nèi)Hp濃度及其基因型與DKD發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4-5]。Hp的三種基因型結(jié)構(gòu)不同,導(dǎo)致其生物學(xué)功能存在差異。不同Hp基因型對糖尿病患者血管并發(fā)癥的影響也不用,Hp基因型可能對DKD具有潛在的預(yù)測價值[6]。然而此前研究[7-14]顯示,Hp基因型在不同人群中的分布差異很大,與DKD的相關(guān)性研究結(jié)論不一致,且目前我國DKD患者人群的相關(guān)研究較少。本研究旨在通過病例對照研究探討血清Hp及Hp基因多態(tài)性與DKD易感性的關(guān)系,為DKD的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科自2018年6月至2019年2月住院的2型糖尿病患者作為研究對象,所有患者均符合世界衛(wèi)生組織糖尿病委員會的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),彼此之間無血緣關(guān)系。依照患者尿白蛋白/肌酐比值(albumin-to-creatinine ratio, ACR)濃度,選擇ACR<30且糖尿病病程大于10年的212例患者定義為對照組;ACR>30的249例糖尿病患者定義為DKD組,即病例組。研究對象排除:1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM);妊娠;考慮存在其他腎疾病;急慢性感染;嚴重心腦血管疾病等。本研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會準(zhǔn)可(倫理審批號:TRECKY2018-037),入選患者均簽署知情同意書。

1.2 資料收集

收集患者住院期間的一般資料信息,包括姓名、性別、年齡、病程、并發(fā)癥及合并癥情況、用藥情況等。測定血壓(患者休息30 min后測量),測量身高、體質(zhì)量,計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)。記錄患者住院期間糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、尿微量白蛋白/肌酐(urinary albumin-to-creatinine ratio, UACR)等生化指標(biāo)結(jié)果。

1.3 標(biāo)本收集

患者禁食12 h后,于清晨空腹抽取靜脈血,常溫3 000 r/min條件下離心5 min,取上清進行分裝后,樣品儲存在-80 ℃,用于后續(xù)基因型與濃度檢測。

1.4 Hp基因型及血Hp測定

將冷凍的標(biāo)本取出,室溫融化,混勻,再次離心取上清后采用丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳法進行基因型檢測。取10 μL血清樣品與2 μL 10%(質(zhì)量分數(shù))血紅蛋白(hemoglobin, Hb)溶液混合,并在室溫下靜置5 min以形成Hp-Hb復(fù)合物。復(fù)合物隨后加入10 μL 20%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖進行平衡。取出電泳裝置,配置7.4%(質(zhì)量分數(shù))丙烯酰胺凝膠作為分離膠, 5%(質(zhì)量分數(shù))丙烯酰胺凝膠作為濃縮膠,將凝膠板放入電泳槽,加入5 mmol/L pH 9.0硼酸鹽電泳緩沖液,按順序依次加入樣本,每條泳道上10 μL。電泳在50 V恒壓下進行4 h。電泳完成后,取出凝膠,滴加聯(lián)苯胺過氧化氫顯色劑,待條帶清晰顯現(xiàn)后,放入蒸餾水中終止反應(yīng),拍照記錄Hp基因型。所需儀器為北京六一DYCZ-24D型電泳槽。

血清樣本中Hp濃度應(yīng)用BNⅡ全自動特定蛋白分析儀(西門子公司,德國)及觸珠蛋白測定試劑盒(和亞公司,中國)通過散射比濁法按操作說明進行測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料和實驗室檢查結(jié)果比較

單純糖尿病組患者均為病程大于10年的患者,其年齡和糖尿病病程顯著高于DKD組(P<0.05)。病例組男性患者、吸煙患者所占比例顯著高于對照組(P<0.05),且其收縮壓、舒張壓、BMI、Scr、BUN、HbA1c、Glu、TG都顯著低于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 受試者一般資料和實驗室檢查結(jié)果比較Tab.1 Comparison of demographic, clinical and laboratory characterization of the subjects

2.2 兩組患者基因型比較

應(yīng)用PAGE電泳法對患者Hp基因型進行鑒定,共檢測出Hp1-1、Hp2-1、Hp2-2 3種基因型(圖1)。3種基因型在2組患者中的頻率見表2。樣本基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.827,P=0.401),提示該樣本具有群體代表性。在兩組患者中,Hp1-1基因型均占比最低,而Hp2-2基因型占比最高。Hp1-1、Hp2-1、Hp2-2 3種基因型分布頻率在病例組分別為8.5%、36.3%、55.2%,在對照組分別為:8.0 %、34.5%、57.4%?；蛐头植冀M間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.234,P=0.89)。Hp等位基因頻率在兩組患者間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.217,P=0.641)(表3)。

表2 Hp基因型在兩組中的出現(xiàn)頻率

表3 兩組間Hp基因分布頻率比較

圖1 Hp基因型電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of Hp genotypes

2.3 兩組患者血清Hp濃度比較

DKD病例組患者血清Hp濃度[0.98(0.66～1.39)]顯著高于對照組患者[0.86(0.63～1.26)] (P<0.05)(圖2)。攜帶Hp1-1基因的患者血清Hp濃度顯著高于其他兩種基因型的患者(圖3)。比較血清Hp與年齡、血壓和Scr等臨床指標(biāo)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),血Hp濃度與血紅蛋白濃度負相關(guān),與年齡、BMI、SBP、DBP、血壓、Scr、HbA1c、BUN等無顯著相關(guān)性(表4)。

表4 血Hp與糖尿病危險因素的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of blood Hp and diabetes risk factors

圖2 血清Hp濃度組間比較Fig.2 Hp levels between two groups*: P<0.05;Hp:haptoglobin.

圖3 不同基因型間的血清Hp濃度Fig.3 Hp levels among different genotypes

3 討論

Hp是一種具有遺傳多態(tài)性的血漿糖蛋白,其基因型的分布表現(xiàn)為區(qū)域和種族差異,Hp1-1為南美最流行的基因型,而在亞洲Hp2-2更為普遍[7]。有關(guān)Hp基因多態(tài)性與DKD關(guān)系的研究大多數(shù)在西方人群中進行,在亞洲人群中缺乏確鑿的證據(jù)。一項以色列的研究[8]表明,DKD患病率及嚴重程度與Hp2-2基因型明顯相關(guān),Hp2-2基因型可能是DKD發(fā)生的主要易感基因。此外,愛爾蘭、埃及、約旦的研究[9-11]均證實Hp2-2基因型與DKD發(fā)生的相關(guān)性。但并不是所有研究都得出一致的結(jié)論,巴西的一項針對265例糖尿病人群的研究[12]及西班牙一項114例糖尿病人群的研究[13]均未發(fā)現(xiàn)Hp2-2基因型與DKD發(fā)生相關(guān)。終末期腎疾病在亞洲人群中的發(fā)病率高于西方人群,且DKD在中國2型糖尿病中的患病率高達52.5%[14]。因而有必要繼續(xù)補充亞洲人群中Hp基因多態(tài)性與DKD易感性的研究,為進一步探討DKD發(fā)病機制及疾病預(yù)測提供基礎(chǔ)。

本文研究比較了糖尿病病程大于10年且無慢性腎病的單純糖尿病患者(對照組)及DKD患者(病例組)Hp基因型分布情況。結(jié)果顯示,Hp1-1、Hp2-1和Hp2-2在對照組中的基因頻率與此前在中國北方糖尿病人群中Hp基因型分布的報道[15]基本一致。本文研究中,與單純糖尿病患者比較,DKD患者3種基因型分布無顯著差異,提示Hp基因型和等位基因頻率與DKD的易感性無關(guān)。這與此前日本、西班牙、約旦和巴西患病人群的研究[12-13,16-17]結(jié)論一致。目前,Hp基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系在不同種群中尚無一致性的結(jié)論,可能與種族、遺傳背景、病例選擇標(biāo)準(zhǔn)、樣本量、其他代謝指標(biāo)控制情況等因素有關(guān)?？紤]到亞洲人群中基因型分布中Hp2-2的占比過高,可能導(dǎo)致統(tǒng)計過程中出現(xiàn)假陰性結(jié)果。本文研究僅基于北京一家醫(yī)療機構(gòu)收治的2型糖尿病患者,結(jié)果是否普遍適用還需進一步大規(guī)模探索。

Hp作為急性期蛋白,主要功能是與血漿中的游離血紅蛋白(Hb)結(jié)合形成Hp-Hb復(fù)合物而被清除,繼而減弱游離Hb導(dǎo)致的一系列氧化反應(yīng)[18]。白細胞介素-6、白細胞介素-1、腫瘤壞死因子α等細胞因子可以與Hp基因調(diào)控位點結(jié)合進而誘導(dǎo)Hp的產(chǎn)生[19-20]。在炎癥進展中,循環(huán)中Hp濃度會升高[21]。目前關(guān)于Hp表達與DKD關(guān)系的研究多集中于尿Hp濃度。多項研究[22-23]表明尿Hp是腎損害的生物標(biāo)志物,對DKD進展具有診斷及預(yù)測價值。血Hp表達與DKD的關(guān)系的研究較少,本文研究發(fā)現(xiàn)DKD組的血Hp濃度明顯高于單純糖尿病組,提示血清Hp濃度可以作為2型糖尿病患者DKD發(fā)生的危險因素。

不同基因型的Hp產(chǎn)物在功能上存在差異,例如與Hb的結(jié)合能力與抗氧化作用具有基因型依賴性,Hp1-1型的抗氧化作用最強,Hp2-2的作用最弱[24]。此外,研究[25]表明Hp基因型對于Hp在患者體內(nèi)的表達情況有影響。本文研究表明,無論是單純糖尿病患者組還是DKD患者組,血清中的Hp濃度與Hp基因型存在顯著相關(guān)性。基因型為Hp2-2的受試者體內(nèi)Hp表達量較低,這一發(fā)現(xiàn)與多份臨床研究[26-27]結(jié)果一致:在歐洲和非洲人群中,發(fā)現(xiàn)Hp1-1基因型的患者循環(huán)中的Hp濃度明顯高于其他兩種基因型的患者。目前尚無明確機制對這一現(xiàn)象進行解釋,但考慮到Hp1與Hp2在與Hb結(jié)合能力上的差異,這一現(xiàn)象或許與其抗氧化生物學(xué)功能有關(guān)。相關(guān)性分析顯示,血清中的Hp濃度與Hb濃度存在顯著相關(guān)性,進而證實血清Hp升高與Hb濃度有關(guān)。因此,在研究血清中的Hp濃度與DKD關(guān)系時,應(yīng)注意觀察人群中的基因型分布情況。

綜上,本文探討了血清Hp濃度和Hp基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系。血清Hp在病例組中的濃度明顯增高,表明Hp與腎功能受損有關(guān)。盡管本文研究未發(fā)現(xiàn)Hp基因型與DKD的患病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián),但Hp基因型會影響血清Hp濃度。這提示血清Hp濃度也可以作為DKD的潛在生物標(biāo)志物,并提示在考慮血清Hp的作用時需要同時考慮Hp基因型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李雨陽:分析數(shù)據(jù),撰寫論文;朱曉蓉、劉婧、鄭曉敏:采集數(shù)據(jù);楊金奎、楊芳遠:提出研究思路,設(shè)計研究方案,撰寫論文。