王紅玫,韓偉,張丹

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院 婦科,重慶 402360)

我國(guó)子宮內(nèi)膜癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中是發(fā)病率僅次于宮頸癌的第二大惡性腫瘤,且其發(fā)病年齡趨于年輕化[1]。子宮內(nèi)膜癌發(fā)生在子宮內(nèi)膜,在女性圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后發(fā)生較多[2]。迄今,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,尋找能夠有效預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的生物標(biāo)志物對(duì)于其靶向治療具有重要意義。神經(jīng)纖毛蛋白-1(NRP1)是一種跨膜糖蛋白,在胚胎組織發(fā)育、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移中有重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn),NRP1表達(dá)上調(diào)改變腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞有絲分裂,刺激腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[4]。踝蛋白1(Talin1)是一種細(xì)胞骨架蛋白,廣泛參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,如癌細(xì)胞的極化、轉(zhuǎn)移等[5-6]。目前,對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織NRP1、Talin1表達(dá)研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中NRP1、Talin1的表達(dá),探究二者與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年1月在我院就診的子宮內(nèi)膜癌患者156例,患者均行手術(shù)治療,術(shù)中收集癌組織和癌旁組織?；颊吣挲g31～76歲,平均(62.50±12.76)歲,其中≥60歲87例,<60歲69例;腫瘤大小≥5 cm 50例,<5 cm 106例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例,未轉(zhuǎn)移110例;腫瘤低分化65例,中、高分化91例;腫瘤浸潤(rùn)深度淺肌層93例,深肌層63例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期99例,Ⅲ期57例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1) 按照《子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南(第四版)》[7]診斷為子宮內(nèi)膜癌的患者;(2) 初診,具有手術(shù)治療指征并接受手術(shù)治療者;(3) 在本院治療前未接受過(guò)放、化療或其它抗腫瘤治療者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1) 伴有慢性疾病,如合并心腦血管疾病等;(2) 合并其他惡性腫瘤;(3) 孕期或哺乳期女性;(4) 有心理或精神障礙。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者及家屬知情并簽署同意書。

1.2 主要儀器和試劑

鼠抗人NRP1抗體購(gòu)自中國(guó)上海恪敏生物科技有限公司;鼠抗人Talin1單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)深圳市康初源有限公司;免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自深圳子科生物有限公司;顯色試劑盒購(gòu)自中國(guó)深圳市康初源有限公司;二抗購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司;石蠟切片機(jī)購(gòu)自中國(guó)上海恪敏生物科技有限公司;顯微鏡購(gòu)自北京德航五洲科技有限公司。

1.3 樣品采集

采集子宮內(nèi)膜癌患者癌組織和癌旁組織,置于無(wú)液氮RNA樣品組織保存液中,-80 ℃保存待測(cè)。

1.4 免疫組化法檢測(cè)NRP1、Talin1表達(dá)情況

采用免疫組化法測(cè)定患者癌組織和癌旁組織NRP1、Talin1表達(dá)水平。用4%甲醛將待測(cè)組織樣本固定24 h,石蠟包埋, 4 μm厚切片。對(duì)切片脫蠟、脫水,加入相應(yīng)的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,然后用PBS沖洗兩次,加入二抗,4 ℃孵育1 h,采用DAB顯色、蘇木素復(fù)染,然后分化、脫水、封片、鏡檢。

1.5 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量評(píng)分法判定表達(dá)結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞比例判定標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%記為0分;25%～50%記為1分;51%～75%記為2分;>75%記為3分。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn):無(wú)染色記為0分;弱染色記為1分;中染色記為2分;強(qiáng)染色記為3分[8]。根據(jù)染色指數(shù)判定結(jié)果,染色指數(shù)為陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積,染色指數(shù)范圍為0～9分,染色指數(shù)≥3分為陽(yáng)性,染色指數(shù)<3分為陰性[9]。評(píng)分過(guò)程由兩名專業(yè)人員操作。

1.6 隨訪

對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后進(jìn)行為期5年的隨訪。隨訪方式為電話隨訪或入院復(fù)查,隨訪內(nèi)容為患者生存情況。隨訪終止時(shí)間為2022年1月,隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束。本研究中,隨訪死亡患者死因均為子宮內(nèi)膜癌。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例表示,行χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析NRP1、Talin1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。采用多因素Cox回歸分析影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織和癌旁組織NRP1、Talin1陽(yáng)性表達(dá)情況

癌組織中NRP1陽(yáng)性率為62.82%,高于癌旁組織的35.26%(P<0.05);Talin1在癌組織中的陽(yáng)性率為61.54%,低于癌旁組織的95.51%(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 癌組織和癌旁組織NRP1、Talin1陽(yáng)性表達(dá)情況 例

A.子宮內(nèi)膜癌組織NRP1的表達(dá);B.癌旁組織NRP1的表達(dá);C.子宮內(nèi)膜癌組織Talin1的表達(dá);D.癌旁組織Talin1的表達(dá)圖1 癌組織和癌旁組織中NRP1、Talin1的陽(yáng)性表達(dá)

2.2 NRP1、Talin1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系

組織分化程度低、臨床分期Ⅲ期的子宮內(nèi)膜癌患者NRP1陽(yáng)性率升高,Talin1陽(yáng)性率降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不同年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)患者NRP1、Talin1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 NRP1、Talin1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 NRP1、Talin1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

對(duì)患者隨訪5年,NRP1陽(yáng)性患者的累計(jì)生存率為61.22%(60/98),陰性患者為93.10%(54/58);Talin1陽(yáng)性患者的累計(jì)生存率為92.71%(89/96),陰性患者為41.67%(25/60)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,NRP1陽(yáng)性患者生存率低于陰性患者(χ2=18.821,P<0.001),Talin1陰性患者生存率低于陽(yáng)性患者(χ2=48.893,P=0.001),見圖2。

圖2 NRP1、Talin1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.4 Cox回歸分析影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素

以子宮內(nèi)膜癌患者生存狀況為因變量(死亡=1,存活=0),以年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)、組織分化程度、臨床分期和NRP1、Talin1表達(dá)為自變量,進(jìn)行Cox回歸分析。單因素、多因素Cox回歸分析結(jié)果均顯示,NRP1陽(yáng)性表達(dá)、Talin1陰性表達(dá)、分化程度低、臨床分期Ⅲ是影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 Cox回歸分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,其發(fā)病率排全球女性罹患癌癥的第六位[7]。近年來(lái),子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率升高、發(fā)病年齡趨于年輕化[10]。子宮內(nèi)膜癌多發(fā)生于絕經(jīng)期、絕經(jīng)后的女性,臨床表現(xiàn)為陰道異常流血,多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期[11]。目前,子宮內(nèi)膜癌的主要治療手段為手術(shù)治療、放療、化療、內(nèi)分泌治療等,但患者預(yù)后較差,生存時(shí)間短[12-13]。迄今,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚。尋找子宮內(nèi)膜癌有效的生物標(biāo)志物,對(duì)改善患者的治療、預(yù)后,提升患者生存質(zhì)量具有重要的意義。

NRP1是屬于神經(jīng)纖毛蛋白家族的一種跨膜受體,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)軸突、促進(jìn)血管新生、修復(fù)血管損傷等功能[4,14]。多項(xiàng)研究表明,NRP1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),在食管鱗狀細(xì)胞癌中NRP1過(guò)表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,刺激食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[15]。因此,NRP1有可能是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。Talin1屬于踝蛋白家族,踝蛋白家族是一類重要的大分子骨架蛋白、調(diào)控蛋白,在不同環(huán)境中具有不同的作用機(jī)制,發(fā)揮特定的功能[16]。Talin1位于細(xì)胞基質(zhì)附著位點(diǎn),通過(guò)活化整合素進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等[17]。迄今,對(duì)子宮內(nèi)膜癌中NRP1和Talin1的表達(dá)水平及其與病情進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系研究較少。本研究結(jié)果顯示,NRP1在癌組織中的表達(dá)水平高于其在癌旁組織中的表達(dá)水平,Talin1在癌組織中的表達(dá)水平低于其在癌旁組織中的表達(dá)水平,說(shuō)明NRP1和Talin1的異常表達(dá)均與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Zhu等[18]發(fā)現(xiàn),膽管癌中NRP1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。已證實(shí),Talin1與肝癌細(xì)胞的遷移和黏附有關(guān),并且可作為肝癌的診斷指標(biāo)[19]。以上研究提示,NRP1、Talin1異常表達(dá)可能通過(guò)某種途徑調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移等活性,進(jìn)而對(duì)疾病進(jìn)展有積極促進(jìn)作用。楊永超等[4]研究顯示,NRP1異常表達(dá)與涎腺腺樣囊性癌的臨床分期、腫瘤細(xì)胞是否侵犯頸部淋巴結(jié)、組織學(xué)類型有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,組織分化程度低和臨床分期Ⅲ期的子宮內(nèi)膜癌患者NRP1陽(yáng)性率升高,Talin1陽(yáng)性率降低,表明NRP1和Talin1可能通過(guò)某種途徑參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展,與病情惡化有關(guān),可作為其臨床檢測(cè)指標(biāo)。此外,NRP1高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)者[20]。有研究[21]表明,在結(jié)直腸癌中,Talin1低表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展,低表達(dá)者預(yù)后較差。結(jié)合NRP1、Talin1表達(dá)情況,本研究采用Kaplan-Meier法分析兩者與子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后關(guān)系,結(jié)果顯示NRP1陽(yáng)性患者的生存率低于陰性患者,Talin1陰性患者的生存率低于陽(yáng)性患者,提示NRP1高表達(dá)、Talin1低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者生存率較低、預(yù)后較差,二者可能成為子宮內(nèi)膜癌治療的潛在靶基因。多因素Cox回歸分析顯示,NRP1高表達(dá)、Talin1低表達(dá)是影響子宮內(nèi)膜癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,提示NRP1高表達(dá)和Talin1低表達(dá)具有評(píng)估子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的作用,通過(guò)檢測(cè)二者表達(dá)水平,臨床可制定合理治療方案,改善治療、預(yù)后效果,降低死亡率。

綜上所述,子宮內(nèi)膜癌患者組織中NRP1表達(dá)上調(diào),Talin1表達(dá)下調(diào),二者與組織分化程度、臨床分期以及患者預(yù)后密切相關(guān),是影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。NRP1和Talin1共同參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,與腫瘤發(fā)展關(guān)系密切,可作為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。臨床可參考二者表達(dá)水平評(píng)估患者病情,進(jìn)而改善預(yù)后。但本研究并未對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制與NRP1和Talin1的關(guān)系進(jìn)行研究,后續(xù)需進(jìn)一步探索二者與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的關(guān)系。