夏君燕,李亞男,章雋,高永紅

(北京航天總醫(yī)院 老年醫(yī)學科, 北京 豐臺 100076)

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年4月至2022年4月在本院就診的老年性癡呆患者120例為疾病組,其中男49例,女71例,年齡60～88歲,平均(71.85±9.65)歲。根據(jù)臨床癡呆評定量表(CDR)評分將患者分為輕度組(CDR評分=1分)42例、中度組(CDR評分=2分)43例、重度組(CDR評分=3分)35例。納入標準:(1) 符合老年性癡呆的相關(guān)診斷標準[7];(2) CDR評分≥1分[8];(3) 簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)評分<26分[9];(4) 肝、腎功能正常;(5) 臨床資料完整。排除標準:(1) 腦部接受過手術(shù)治療的患者;(2) 其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的癡呆患者;(3) 參加本研究前接受過相關(guān)治療的患者;(4) 伴有器質(zhì)性病變患者;(5) 不能配合完成研究的患者。另選取同期健康體檢志愿者120例作為對照組,其中男56例,女64例,年齡62～87歲,平均(72.30±9.42)歲。所有受試者對本研究內(nèi)容知情并簽署書面同意書。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 細胞與主要試劑

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y(貨號:CC-Y1459)購自美國ATCC公司。Trizol試劑盒(貨號:15596026)購自賽默飛世爾科技公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:RRO47AA)購自日本TaKaRa公司;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號:Code NO. RR420L)購自日本TaKaRa公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號:T002)購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑(貨號:L3000-015)購自美國Invitrogen公司;SP1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號:ab227383、ab181602)購自英國Abcam公司;噻唑藍(MTT)(貨號:M8180-1)購自北京索萊寶科技有限公司;異硫氰酸熒光素標記膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號:WK304)購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集 收集兩組一般資料。(1) 人口學資料:性別、年齡、教育年限、吸煙史、飲酒史;(2) 基礎(chǔ)疾病:高血壓、高血脂、糖尿病;(3) 生化指標:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、β-淀粉樣蛋白肽1-42(Aβ1-42)、磷酸化tau(P-tau)蛋白。

1.3.2 樣本采集 BD真空采血管收集所有研究對象清晨空腹狀態(tài)下的靜脈血10 ml,4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,置-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.3 血清miR-375、SP1 mRNA表達水平檢測 按Trizol試劑盒說明書操作,提取血清中總RNA,使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,采用qRT-PCR儀檢測血清miR-375、SP1 mRNA的相對表達水平。PCR反應體系20 μl:cDNA模板1 μl、ddH2O 7 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×Taq PCR master mix 10 μl;反應條件為95 ℃初始變性30 s;95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,40個循環(huán)。每組實驗重復3次。使用2-ΔΔCt方法分析血清miR-375、SP1 mRNA表達水平。miR-375以U6作為內(nèi)參基因,SP1 mRNA以GAPDH作為內(nèi)參基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?分別構(gòu)建SP1野生型質(zhì)粒(WT-SP1)及突變型質(zhì)粒(MUT-SP1),將WT-SP1和MUT-SP1分別與mimic NC或miR-375 mimic共轉(zhuǎn)染于293t細胞,48 h后檢測熒光素酶活性。

1.3.5 細胞分組、轉(zhuǎn)染與老年性癡呆體外細胞模型構(gòu)建 SH-SY5Y細胞采用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞分為對照組、模型組、mimic NC組和miR-375 mimic組。其中,mimic NC組和miR-375 mimic組細胞使用Lipofectamine?3 000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染mimic NC或miR-375 mimic,轉(zhuǎn)染48 h后使用含5 μmol·L-1β-淀粉樣蛋白肽25-35(Aβ25-35)的DMEM培養(yǎng)基處理細胞24 h以構(gòu)建老年性癡呆體外細胞模型[10];模型組細胞僅使用含5 μmol·L-1Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基處理細胞24 h;對照組細胞不進行任何特殊處理。處理結(jié)束后收集細胞,qRT-PCR法檢測細胞中miR-375、SP1 mRNA表達水平(具體操作步驟參照1.3.3);蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中SP1蛋白表達水平;MTT法檢測細胞活力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組SH-SY5Y細胞中SP1蛋白表達水平 收集處理后的各組SH-SY5Y細胞,使用裂解液充分裂解后提取細胞中總蛋白。SDS-PAGE電泳分離等量變性蛋白,將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后添加一抗(SP1、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜,添加二抗室溫孵育1.5 h,化學發(fā)光試劑顯色,凝膠成像分析系統(tǒng)掃描圖像,Image J軟件分析蛋白條帶灰度(GAPDH為內(nèi)參蛋白)。

夜很靜。盡管街道上有車，有人，但這一切對我來說，都是無聲的。夏夜的涼風吹在我身上，這是我對外界的唯一感知。我很緊張。我即將去完成一件大事，生死攸關(guān)的大事。

1.3.7 MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞活力 將處理后的各組SH-SY5Y細胞以3 000個·孔-1接種于96孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔添加20 μl MTT溶液(5 mg· ml-1),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液,添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)充分混勻并孵育15 min,使用酶標儀檢測各孔細胞在490 nm波長處的OD值(OD490 nm),以O(shè)D490 nm表示細胞活力。

1.3.8 流式細胞術(shù)檢測各組SH-SY5Y細胞凋亡率 收集處理后的各組SH-SY5Y細胞,將5×104個細胞使用185 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸,隨后添加10 μl Annexin V-FITC、5 μl PI室溫避光孵育10 min、5 min,使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料的比較

兩組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓、高血脂、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、Scr比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),兩組受教育年限、Aβ1-42、P-tau蛋白比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組一般資料的比較(n=120)

2.2 兩組血清miR-375、SP1mRNA表達水平及MMSE評分比較

疾病組血清miR-375表達水平、MMSE評分顯著低于對照組,SP1 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.001),見表3。

表3 兩組血清miR-375、SP1mRNA表達水平及MMSE評分比較

2.3 不同病情程度組血清miR-375、SP1mRNA表達水平及MMSE評分比較

重度組、中度組血清miR-375表達水平、MMSE評分顯著低于輕度組,SP1 mRNA表達水平顯著高于輕度組(P<0.05);重度組血清miR-375表達水平、MMSE評分顯著低于中度組,SP1 mRNA表達水平顯著高于中度組(P<0.05)。見表4。

表4 不同病情程度組血清miR-375、SP1表達水平及MMSE評分比較

2.4 疾病組血清miR-375與SP1 mRNA表達水平及兩者與MMSE評分的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示,疾病組血清miR-375與SP1 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.627,P<0.05);Spearman相關(guān)分析顯示,血清miR-375表達水平與MMSE評分呈正相關(guān)(r=0.664,P<0.05),血清SP1 mRNA表達水平與MMSE評分呈負相關(guān)(r=-0.472,P<0.05)。見圖1。

A.miR-375與SP1 mRNA的相關(guān)性;B.miR-375與MMSE評分的相關(guān)性;C.SP1 mRNA與MMSE評分的相關(guān)性圖1 血清miR-375與SP1 mRNA表達水平及兩者與MMSE評分的相關(guān)性

2.5 多因素Logistic回歸分析影響老年性癡呆發(fā)生的危險因素

以是否發(fā)生老年性癡呆為因變量,以受教育年限、MMSE評分、miR-375和SP1 mRNA表達水平為自變量建立多因素Logistic回歸模型,結(jié)果顯示,低MMSE評分、miR-375低表達、SP1 mRNA高表達是影響老年性癡呆發(fā)生的危險因素(P<0.05),見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析影響老年性癡呆發(fā)生的危險因素

2.6 ROC曲線分析血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分對老年性癡呆患者病情進展為重度的預測價值

以老年性癡呆患者病情是否進展為重度為狀態(tài)變量,血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分以及三者聯(lián)合預測概率值(通過二元Logistic回歸分析得到)為檢驗變量繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分預測老年性癡呆患者病情進展為重度的AUC分別為0.823(95%CI0.750～0.896)、0.780(95%CI0.689～0.871)、0.851(95%CI0.781～0.921),臨界值分別為0.65、1.60、15,敏感度分別為91.43%、68.57%、85.71%,特異性分別為68.24%、77.65%、65.88%;三者聯(lián)合預測的AUC為0.938(95%CI0.879～0.974),顯著高于血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分單獨預測的AUC(Z=2.734、3.150、2.113,P<0.05),且敏感度高達97.14%,特異性為78.82%。見圖2。

圖2 血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分預測老年性癡呆患者病情進展為重度的ROC曲線

2.7 miR-375靶向調(diào)控SP1

TargetScanHuman網(wǎng)址預測miR-375與SP1間存在結(jié)合位點,見圖3。與mimic NC和WT-SP1共轉(zhuǎn)染組比較,miR-375 mimic和WT-SP1共轉(zhuǎn)染組細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與mimic NC和MUT-SP1共轉(zhuǎn)染組比較,miR-375 mimic和MUT-SP1共轉(zhuǎn)染組細胞熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表6。

圖3 TargetScanHuman網(wǎng)址預測miR-375與SP1結(jié)合位點

表6 熒光素酶活性比較

2.8 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中SP1 mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較,模型組SH-SY5Y細胞中miR-375表達水平顯著降低,SP1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,mimic NC組SH-SY5Y細胞中miR-375以及SP1 mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與模型組、mimic NC組比較,miR-375 mimic組SH-SY5Y細胞中miR-375表達水平顯著升高,SP1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表7。

A.對照組;B.模型組;C.mimic NC組;D.miR-375 mimic組圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中SP1蛋白表達的影響

表7 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中SP1 mRNA和蛋白表達的影響

2.9 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力和凋亡率的影響

與對照組比較,模型組SH-SY5Y細胞活力顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組比較,mimic NC組SH-SY5Y細胞活力和凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與模型組、mimic NC組比較,miR-375 mimic組SH-SY5Y細胞活力顯著升高,凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、表8。

圖5 流式細胞術(shù)檢測過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

表8 過表達miR-375對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力和凋亡率的影響

3 討 論

65歲以上老人老年性癡呆的發(fā)病率為5%左右[11],臨床主要表現(xiàn)為記憶障礙、認知衰退、視空間能力損害,給患者日常生活造成困擾。老年性癡呆發(fā)病機制復雜,臨床進展受多種因素影響,目前缺乏有效的診斷和治療手段[6,12],已成為21世紀醫(yī)學界急需解決的重大健康問題。尋找新的生物標志物,有助于臨床評估患者病情,制定靶向治療方案,延緩病情進展,提高患者生活質(zhì)量。

阿爾茨海默病患者腦脊液中的Aβ能夠在神經(jīng)細胞外異常沉積,引起神經(jīng)突退縮和神經(jīng)元變性,同時還會造成血管平滑肌變性。tau蛋白能夠與微管結(jié)合維持微管的穩(wěn)定性,微管系統(tǒng)是神經(jīng)骨架的主要成分,tau蛋白過度磷酸化后,神經(jīng)骨架受到損壞,正常的軸突轉(zhuǎn)運受損,造成神經(jīng)元功能損傷。腦脊液中低水平Aβ1-42和高水平P-tau蛋白是臨床推薦的阿爾茨海默病的生物標志物[13]。本研究發(fā)現(xiàn),疾病組Aβ1-42水平低于對照組,P-tau蛋白水平高于對照組,與腦脊液中兩者變化趨勢一致[13],提示臨床可通過檢測血清中Aβ1-42和P-tau蛋白水平進行判斷,與檢測腦脊液中兩者水平比較更容易獲取檢測樣本。

此外,多種miRNA已被證實與阿爾茨海默病相關(guān),可作為該疾病的生物標志物[12,14]。本研究中,疾病組miR-375表達降低,且MMSE評分越低miR-375水平越低,表明miR-375在老年性癡呆中起保護作用。研究證實,miR-375/SIX軸可接受lncRNA WT1-AS的調(diào)控,參與阿爾茨海默病的神經(jīng)元氧化應激損傷和細胞凋亡[15]。Ashmwe等[16]采用體外沖擊波治療脊髓損傷大鼠,治療后miR-375表達增加,表明miR-375具有神經(jīng)保護作用。SP1已被證實是阿爾茨海默病的關(guān)鍵調(diào)控基因[17],且SP1能通過結(jié)合促炎轉(zhuǎn)錄因子如核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)、核因子κB(NF-κB)和p53等調(diào)節(jié)阿爾茨海默病中重要基因如Aβ前體蛋白(APP)和β-分泌酶1(BACE1)的表達,同時也可能接受與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)的重要細胞因子白介素-1β(IL-1β)的調(diào)節(jié)[18]。在帕金森病大鼠模型中,上調(diào)miR-375能夠抑制SP1的表達,改善多巴胺能神經(jīng)元的損傷,并且能夠減輕炎癥反應和氧化應激[19]。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-375/SP1軸可接受lncRNA 01138的調(diào)控,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有氧糖酵解和細胞增殖中發(fā)揮作用。本研究中,老年性癡呆患者血清SP1 mRNA表達水平顯著升高,且病情越嚴重SP1 mRNA表達水平越高,提示SP1高表達可能在老年性癡呆發(fā)生和病情進展中起促進作用。進一步分析顯示,老年性癡呆患者血清miR-375與SP1 mRNA表達水平呈負相關(guān),miR-375低表達、SP1高表達均是影響老年性癡呆發(fā)生的危險因素,表明miR-375可能通過負向調(diào)控SP1在老年性癡呆發(fā)生和病情進展過程中發(fā)揮作用。此外,血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分以及三者聯(lián)合預測老年性癡呆患者病情進展為重度的曲線下面積(AUC)分別為0.823、0.780、0.851、0.938,三者聯(lián)合預測的AUC顯著高于單個指標預測的AUC,且三者聯(lián)合預測的敏感度高達97.14%,特異性為78.82%,表明血清miR-375、SP1 mRNA表達水平和MMSE評分均具有一定預測老年性癡呆患者病情進展為重度的價值,且三者聯(lián)合預測的價值較高。以上研究結(jié)果提示,血清miR-375、SP1 mRNA具有成為評估老年性癡呆發(fā)生及病情嚴重程度輔助指標的潛力。

TargetScanHuman網(wǎng)址預測發(fā)現(xiàn)miR-375與SP1間存在結(jié)合位點,雙熒光素酶實驗證實miR-375能夠直接靶向SP1。老年性癡呆、帕金森病和神經(jīng)膠質(zhì)瘤均屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病,推測miR-375、SP1可能通過miR-375/SP1軸調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞增殖、凋亡、分化等生物學過程,進而在老年性癡呆發(fā)生發(fā)展中協(xié)同發(fā)揮作用。本研究以人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y(老年性癡呆發(fā)病機制研究常用細胞模型之一[21])為研究對象,通過Aβ25-35誘導構(gòu)建老年性癡呆體外細胞模型初步探究miR-375、SP1在老年性癡呆中的具體作用機制。結(jié)果顯示,Aβ25-35誘導后,SH-SY5Y細胞中miR-375表達水平、細胞活力降低,而SP1 mRNA和蛋白表達水平以及細胞凋亡率升高,此結(jié)果與miR-375、SP1在老年性癡呆患者血清中的表達趨勢一致,提示miR-375、SP1可能通過相互作用參與Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞損傷過程。進一步分析顯示,過表達miR-375能夠升高Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力,同時降低SP1 mRNA和蛋白表達以及細胞凋亡率,該結(jié)果進一步證實了miR-375可能通過負靶向調(diào)控SP1表達影響Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞增殖、凋亡,進而參與調(diào)控老年性癡呆發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,老年性癡呆患者血清miR-375表達水平明顯降低,SP1 mRNA表達水平明顯升高,兩者呈負相關(guān),且均與患者病情及認知功能具有一定的相關(guān)性。但本研究樣本量較小,試驗數(shù)據(jù)可能存在一定的偏倚。同時由于研究條件的限制,本研究僅初步分析了miR-375對SP1的靶向調(diào)控作用以及二者參與老年性癡呆的作用機制。后續(xù)可擴大樣本數(shù)量,并結(jié)合更多的細胞實驗、動物實驗等基礎(chǔ)研究對兩者的具體作用機制進行深入探討。