段戰(zhàn)鋒,張巍巍,申曉燕

(河南省許昌市中心醫(yī)院鹿鳴湖院區(qū)1.腫瘤內(nèi)科二病區(qū),2.胃腸外科,河南 許昌 461000)

胃癌是人類(lèi)消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。它是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因,雖然目前針對(duì)胃癌的臨床治療有多種選擇,但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌治療的最大障礙[2],且患者的預(yù)后很差,尤其是在腫瘤晚期[3]。胃癌患者的5年總生存率僅約30%[3]。這主要是由于對(duì)癌癥異質(zhì)性的了解較少,以及缺乏理想的生物標(biāo)志物用于早期檢測(cè)。因此,確定胃癌的分子特征,尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種小型非編碼RNA,可以調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步促進(jìn)或抑制腫瘤基因表達(dá)。到目前為止,數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)鑒定和報(bào)道了一千多個(gè)人類(lèi)miRNA[4],其中一些已經(jīng)被用作診斷、預(yù)后和治療的分子生物標(biāo)志物。miR-340-5p是一種研究較少的miRNA,但已有證據(jù)表明其在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病中發(fā)揮重要作用[5-7]。MICAL2(Molecule interacting with Cacl 2)是MICALs家族的一個(gè)特殊成員,已被確定為多種癌癥的腫瘤促進(jìn)劑,包括前列腺癌、胃癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌,參與細(xì)胞遷移、侵襲、變形和增殖[8]。尚不清楚miR-340-5p是否通過(guò)靶向MICAL2參與胃癌的發(fā)生。因此,本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中MICAL2、miR-340-5p的表達(dá),探討二者在胃癌組織中的作用及關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2018年6月本院收治的胃癌患者為研究對(duì)象,收集96例手術(shù)患者的胃癌組織及離腫瘤邊緣5 cm處的癌旁組織。離體組織迅速置于液氮中冷凍,之后轉(zhuǎn)移到-80 ℃保存至使用,且所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)?；颊咧心?6例,女30例。

根據(jù)腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)對(duì)腫瘤進(jìn)行分期,Ⅰ期和Ⅱ期共35例,Ⅲ期和Ⅳ期共61例。組織學(xué)分級(jí)按照國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南進(jìn)行評(píng)估。納入標(biāo)準(zhǔn):(1) 首次確診,未采用其他治療方案治療;(2) 通過(guò)影像學(xué)檢查、病理檢查確診為胃癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1) 合并其他惡性腫瘤者;(2) 造影劑過(guò)敏者;(3) 有慢性胃炎、胃出血、胃穿孔等胃部疾病者;(4) 臨床資料不完整者。本研究經(jīng)我院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),所有樣品采集均取得受試者知情同意,符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)組織中miR-340-5p水平 使用TRIzol試劑(Ambion,USA)從組織樣品中提取總RNA,取1 μg總RNA作為模板,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。采用GoTaq qPCR Master Mix(Promega)在Mx3005P Real-time PCR系統(tǒng)(Stratagene,USA)上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 min預(yù)變性,95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;共循環(huán)45次。以U6作內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法對(duì)組織miR-340-5p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。miR-340-5p及內(nèi)參引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色觀察組織中MICAL2蛋白表達(dá)情況 免疫組化分析采用EnVision兩步法進(jìn)行。操作按照實(shí)驗(yàn)室程序和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將保存的胃癌以及癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟切片,常規(guī)脫蠟、水合,3%雙氧水作用8 mim去除內(nèi)源性酶活性,檸檬酸修復(fù)抗原,PBS沖洗3次,每次3 min,除去PBS后加入一抗(MICAL2兔多克隆抗體)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗后加入二抗37 ℃孵育20 min,DAB染色,蘇木精復(fù)染。脫水、透明后封片,PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行病理圖像分析,于光學(xué)顯微鏡下觀察,根據(jù)顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率綜合計(jì)分。細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中未觀察到棕黃色顆粒狀沉淀為0分,細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈淡黃色顆粒狀沉淀為1分,細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淺棕色顆粒狀沉淀為2分,細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀為3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分率<10%為1分,陽(yáng)性細(xì)胞百分率10%～50%為2分,陽(yáng)性細(xì)胞百分率>50%為3分。綜合計(jì)分為以上兩種評(píng)分相加,≤3分為低表達(dá),>3分為高表達(dá)。

1.2.3 Western-blot法檢測(cè)MICAL2蛋白表達(dá)水平 將組織樣品置于含有蛋白裂解劑的冰中孵育30 min,然后在4 ℃下離心30 min,利用二辛可寧酸(BCA)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取50 μg總蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉2 h后,將膜與MICAL2一抗[貨號(hào):ab241260,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]和GAPDH[貨號(hào):ab8245,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后用TBS-Tween-20(TBST)洗滌膜,并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗[貨號(hào):ab9482,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]在室溫下放置60 min。用TBST洗滌后,使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(EMD Millipore)對(duì)膜進(jìn)行顯影。使用ImageJ 2.1軟件對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量。

1.3 隨訪

所有患者自術(shù)后開(kāi)始門(mén)診或者電話定期隨訪,觀察患者的生存時(shí)間和生存率,隨訪截止時(shí)間為2021年6月,終點(diǎn)事件為患者死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中miR-340-5p表達(dá)水平的比較

胃癌組織中miR-340-5p表達(dá)水平高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胃癌組織與癌旁組織中miR-340-5p表達(dá)水平的比較Tab 2 Comparison of miR-340-5p levels in gastric cancer tissues and adjacent

2.2 胃癌組織和癌旁組織中MICAL2蛋白的表達(dá)情況

胃癌組織中MICAL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為71.88%(69/96),癌旁組織中MICAL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為11.46%(11/96),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=72.086,P<0.001)。胃癌患者組織中MICAL2蛋白的表達(dá)水平高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、表3。

圖1 MICAL2蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of MICAL2 protein in gastric cancer and adjacent tissues

表3 胃癌組織與癌旁組織中MICAL2蛋白表達(dá)水平的比較Tab 3 Comparison of MICAL2 protein expression levels in gastric cancer tissues and adjacent

2.3 胃癌患者中MICAL2、miR-340-5p表達(dá)的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示,胃癌患者組織中MICAL2表達(dá)與miR-340-5p表達(dá)呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.313,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 胃癌患者中MICAL2表達(dá)與miR-340-5p表達(dá)的相關(guān)性Fig 2 Correlation between MICAL2 and miR-340-5p expression in patients with gastric cancer

2.4 MICAL2蛋白和miR-340-5p表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胃癌組織中MICAL2蛋白和miR-340-5p表達(dá)與年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)程度、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 胃癌組織中MICAL2蛋白、miR-340-5p的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 4 Relationship between the expression of MICAL2 protein, miR-340-5p and clinicopathological parameters in gastric cancer tissues

2.5 Kaplan-Meier生存分析

96例患者均完成3年隨訪,末次隨訪日期2021年6月30日,共32例死亡,64例存活。以miR-340-5p、MICAL2相對(duì)表達(dá)量均值為基準(zhǔn),超出該范圍判定為高表達(dá),低于該范圍定義為低表達(dá)。繪制3年生存曲線,Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,miR-340-5p高表達(dá)組患者3年累積生存率(80.00%)顯著低于低表達(dá)組(52.17%)(Log rankχ2=9.096,P=0.003),MICAL2蛋白高表達(dá)組患者3年累積生存率(72.46%)顯著低于低表達(dá)組(51.85%)(Log rankχ2=4.329,P=0.037),見(jiàn)圖3。

圖3 不同MICAL2、miR-340-5p表達(dá)患者Kaplan-Meier生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival curve of patients with different MICAL2 and miR-340-5p expressions

2.6 影響胃癌患者預(yù)后的Cox回歸分析

以是否死亡為因變量,miR-340-5p、MICAL2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為自變量進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示MICAL2、miR-340-5p、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 影響胃癌患者預(yù)后的Cox回歸分析Tab 5 Cox regression analysis of influence on prognosis of patients with gastric cancer

3 討 論

胃癌早期癥狀與一般胃病相似,是一種發(fā)病隱匿的惡性腫瘤,被發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已處于腫瘤晚期[9]。目前,我國(guó)每年新增多達(dá)40萬(wàn)胃癌病例,其發(fā)病率僅次于肺癌,死亡率僅次于肺癌和肝癌,已成為威脅民眾健康的重大疾病之一[10-13]。因此,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高療效和生存率的關(guān)鍵。

miRNA是由20～24個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA分子,主要參與各種細(xì)胞活動(dòng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。然而,miRNA的異常改變與多種生物學(xué)過(guò)程有關(guān),包括腫瘤形成、血管生成和脂質(zhì)代謝的改變。它們通常通過(guò)靶向癌基因、腫瘤抑制基因、轉(zhuǎn)錄因子以及其他涉及細(xì)胞死亡和生存的調(diào)控因子來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥性[15]。miR-340被報(bào)道為乳腺癌的抑制性miRNA[16]。對(duì)結(jié)直腸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃癌的研究證實(shí),miR-340在癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮抑制作用[17-18]。Xiao等[19]研究發(fā)現(xiàn),miR-340-5p在胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào),表明miR-340可能在胃癌中發(fā)揮促癌作用。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中miR-340-5p表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,胃癌組織中miR-340-5p表達(dá)與年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)程度、腫瘤大小無(wú)關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān),提示miR-340-5p可能參與胃癌的發(fā)展進(jìn)程,推測(cè)miR-340-5p水平的升高可能通過(guò)促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移累及其它器官或系統(tǒng),促使癌癥惡化。本研究Kaplan-Meier分析顯示,miR-340-5p高表達(dá)組患者3年累積生存率顯著低于低表達(dá)組,提示miR-340-5p表達(dá)水平還可影響預(yù)后。

MICAL2是MICALs家族的成員之一,MICALs是一個(gè)進(jìn)化保守家族,涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、軸突引導(dǎo)、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞凋亡,參與細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和相關(guān)基本生物過(guò)程的調(diào)控[20]。Zhou等[8]研究發(fā)現(xiàn),MICAL2可促進(jìn)肺腺癌的侵襲和生長(zhǎng)。另有研究[21]發(fā)現(xiàn),MICAL2在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)參與炎癥誘導(dǎo)的新血管生成,而誘導(dǎo)血管生成能力是公認(rèn)的癌細(xì)胞特性。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),胃癌組織中MICAL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為71.88%,顯著高于癌旁組織中的11.46%(11/96);進(jìn)一步通過(guò)Western blot定量分析發(fā)現(xiàn),胃癌組織中MICAL2蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,胃癌組織中MICAL2蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、分化程度、浸潤(rùn)程度、腫瘤大小無(wú)關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān),提示MICAL2蛋白也與胃癌的惡性程度相關(guān),可能通過(guò)影響炎癥誘導(dǎo)的新血管生成促進(jìn)癌癥進(jìn)展。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,MICAL2蛋白高表達(dá)組患者3年累積生存率顯著低于低表達(dá)組,提示MICAL2蛋白表達(dá)水平可影響患者3年累積生存率。本研究進(jìn)一步使用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),胃癌組織中MICAL2與miR-340-5p表達(dá)水平呈正相關(guān),提示二者在胃癌中可能存在正調(diào)控機(jī)制共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展并影響患者的預(yù)后。Cox回歸分析結(jié)果顯示,MICAL2和miR-340-5p高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,提示對(duì)于MICAL2、miR-340-5p高表達(dá)的患者,應(yīng)該在術(shù)后給予更嚴(yán)密的隨訪觀察,必要時(shí)給予輔助治療,以期改善預(yù)后。

綜上所述,MICAL2和miR-340-5p在胃癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá),二者與胃癌病情發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān),有望成為新的胃癌靶標(biāo),為開(kāi)發(fā)新的診治方法及判斷預(yù)后提供參考依據(jù)。但目前二者在胃癌發(fā)展中的確切機(jī)制尚不明確,需在今后進(jìn)行更深入的研究。