王茜，雷正瑤，王順利，莫瓊?cè)A，易祥華,3，蔣銘華

1上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院病理科，上海 201505

2同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科，上海 200065

3新疆臨床基因檢測(cè)與生物醫(yī)學(xué)信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 克拉瑪依 834000

4復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院/上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201100

宮頸癌是世界范圍內(nèi)病死率前五位的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)[2]，在中國宮頸癌發(fā)病例數(shù)也不斷增多[3]。宮頸癌是女性腫瘤死亡的重要原因，持續(xù)的人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要原因，除HPV 感染外，包括微小RNA（microRNA，miRNA）在內(nèi)的遺傳和表觀遺傳因素也參與了宮頸癌的發(fā)生。miRNA 與宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，其在宮頸癌中的作用日益受到重視[4]。從功能和機(jī)制的角度來看，miRNA 已被明確在宮頸癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中具有一定作用，但還需要更全面的臨床試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)基于miRNA 的診斷和治療方法的臨床轉(zhuǎn)化[5]。目前的研究普遍認(rèn)為miRNA-27 在宮頸癌中表達(dá)升高，且與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]，靶向miRNA-27 能夠抑制宮頸癌進(jìn)展[7]，但具體機(jī)制尚不完全明確。研究表明，miRNA 能夠調(diào)控人體約1/3 的基因，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中起著重要甚至關(guān)鍵作用，因此成為臨床研究熱點(diǎn)。miRNA-27 與細(xì)胞凋亡也存在一定的關(guān)系[8]，其潛在靶點(diǎn)LETM1 結(jié)構(gòu)域蛋白1（LETM1 domain containing 1，LETMD1）是線粒體外膜的結(jié)構(gòu)蛋白組成之一[9]，在宮頸癌中的相關(guān)研究尚不充足。本研究分析miRNA-27 與宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的關(guān)系，探討miRNA-27 在宮頸癌中的作用網(wǎng)絡(luò)和機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

宮頸癌SiHa 細(xì)胞株購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI1640 培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海）股份有限公司，順鉑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Trizol、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒均購自Takara公司，miRNA 互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）合成試劑盒、mRNA cDNA合成試劑盒分別購自生工生物工程（上海）股份有限公司和Taraka公司，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 miRNA-27 成熟體檢測(cè)及表達(dá)分析

通過檢索miRBase 數(shù)據(jù)庫[10]鑒定miRNA-27 的成熟體序列，通過miRNA 相關(guān)腫瘤生物信息Oncomir 數(shù)據(jù)庫[11]分析其在宮頸癌中的表達(dá)情況。

1.3 miRNA-27 相關(guān)靶基因分析

通過檢索常用的miRNA 數(shù)據(jù)庫miRDB、Targetscan7.2 和ENCORI[12-14]預(yù)測(cè)miRNA-27 的4 種成熟體的可能靶基因。將全部可能靶基因納入DAVID[15]分析工具，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，結(jié)合GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫篩選與線粒體凋亡途徑直接相關(guān)的基因，并通過ENCORI 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證所選基因與miRNA-27 表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 構(gòu)建細(xì)胞凋亡模型

以參考文獻(xiàn)[16]為依據(jù)，通過順鉑誘導(dǎo)構(gòu)建宮頸癌細(xì)胞SiHa 凋亡模型（順鉑組），主要步驟如下：采用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）常規(guī)培養(yǎng)宮頸癌SiHa 細(xì)胞株，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，實(shí)驗(yàn)前24 h 將細(xì)胞接種于6 孔板中，隨后更換為含有5 μmol/L 順鉑的培養(yǎng)基（提前配置），細(xì)胞繼續(xù)常規(guī)條件孵育24 h 后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)；以無順鉑干預(yù)的細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)靶基因表達(dá)情況

將體外6 孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞經(jīng)無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗后，每孔用1 ml Trizol 裂解消化細(xì)胞，加入200 μl 氯仿振蕩混勻后，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相至新離心管后加入0.5 ml 異丙醇沉淀RNA 并再次12 000 r/min、4 ℃離心15 min，隨后加入1 ml 75%乙醇溫和清洗沉淀，8000 r/min、4 ℃離心5 min后收集總RNA，進(jìn)一步通過polyA 加尾法逆轉(zhuǎn)錄合成miRNA cDNA 第一鏈，將稀釋后的cDNA 通過熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，檢測(cè)靶基因的表達(dá)情況，所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。miRNA-27 分析以U6為內(nèi)參，U6上游引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游引物5'-GCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'；miRNA-27 上 游引物為其自身序列（miRNA-27a-3p：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'；miRNA-27a-5p：5'-AGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3'；miRNA-27b-3p：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3'；miRNA-27b-5p：5'-AGAGCTTAGCTGATTGGTGAAC-3'），下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LETMD1分析以β-actin為內(nèi)參，β-actin上游引物5'-GTTGTCGACGACGAGCG- 3'，下游引物 5'- GCACAGAGCCTCGCCTT-3'；LETMD1上游引物5'-CGTCATTTCCCCCGCTTCTA- 3'，下游引物5'-GCATCAGCCCATAACATCTGC-3'。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-27的成熟體序列及在宮頸癌中的表達(dá)

通過miRBase 生物信息數(shù)據(jù)庫檢索分析miRNA-27，發(fā)現(xiàn)hsa-miRNA-27 存在4 種成熟體hsamiRNA-27a-3p、hsa-miRNA-27a-5p、hsa-miRNA-27b-3p 和hsa-miRNA-27b-5p（表1）。隨后進(jìn)一步在Oncomir 數(shù)據(jù)庫中分析這4 種成熟體的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤中miRNA-27 存在不同的表達(dá)水平，在宮頸癌中miRNA-27 不同成熟體也存在不同的表達(dá)水平，其中hsa-miRNA-27a-3p 與hsa-miRNA-27b-3p 的表達(dá)水平明顯高于hsa-miRNA-27a-5p 和hsa-miRNA-27b-5p（圖1）。

圖1 Oncomir數(shù)據(jù)庫中miRNA-27在不同腫瘤中的表達(dá)情況

表1 miRNA-27 的成熟體序列

2.2 miRNA-27 靶基因的生物信息分析

通過miRDB、Targetscan7.2 和ENCORI 數(shù)據(jù)庫分析miRNA-27 的4 種成熟體可能的靶基因，整合上述數(shù)據(jù)庫靶基因數(shù)據(jù)并通過DAVID 進(jìn)行GO 和KEGG 信號(hào)通路分析。KEGG 信號(hào)通路富集分析顯示，miRNA-27 的靶基因主要參與腫瘤的信號(hào)通路，這些通路與細(xì)胞凋亡均存在密切關(guān)系；GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-27 與線粒體外膜相關(guān)。（圖2）

圖2 miRNA-27靶基因GO和KEGG通路富集分析

2.3 線粒體途徑凋亡相關(guān)基因

DAVID 生物信息分析結(jié)果顯示，miRNA-27 的靶基因中有部分基因與線粒體外膜相關(guān)，可能與線粒體途徑的凋亡存在密切關(guān)系，其中包括LETMD1、?；o酶A 合成酶長鏈家族成員6（acyl-CoA synthetase long chain family member 6，ACSL6）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1B（carnitine palmitoyltransferase 1B，CPT1B）等。（圖3）

圖3 線粒體途徑凋亡相關(guān)的miRNA-27的靶基因（GeneMANIA數(shù)據(jù)庫）

2.4 miRNA-27 與LETMD1 的相關(guān)性

通過miRNA-Target CoExpression 生物信息分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-27 的4 種成熟體中miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p 與LETMD1 共表達(dá)存在相關(guān)性（P﹤0.05），miRNA-27b-3p、miRNA-27b-5p 與LETMD1 共表達(dá)無相關(guān)性（P﹥0.05）。（表2）

表2 miRNA-27 的4 種成熟體與LETMD1 在宮頸癌中的共表達(dá)情況（ENCORI 數(shù)據(jù)庫）

2.5 miRNA-27a 和LETMD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過宮頸癌細(xì)胞凋亡模型驗(yàn)證miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p 和LETMD1 的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑組中miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p 相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組，LETMD1mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表3）

表3 不同組別SiHa細(xì)胞中miRNA-27a與LETMD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

表3 不同組別SiHa細(xì)胞中miRNA-27a與LETMD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

組別空白對(duì)照組順鉑組t值P值miRNA-27a-3p 1.00±0.05 0.45±0.01 10.740<0.01 miRNA-27a-5p 1.00±0.13 0.63±0.01 2.902<0.05 LETMD1 mRNA 1.00±0.10 2.07±0.33 3.109<0.05

3 討論

在過去的幾十年中，miRNA 作為與人類和其他生物基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的重要分子，為疾病的診斷和治療提供了很多可用策略[17]。研究miRNA的分子作用機(jī)制有助于開發(fā)基于miRNA 的宮頸癌治療策略，彌補(bǔ)現(xiàn)有治療方案的不足。miRNA 作為與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物分子，有助于病變的早期診斷[18]。

研究顯示，miRNA-27 與宮頸病變的惡性程度密切相關(guān)，存在多樣化作用方式，例如miRNA-27a可以通過靶向其下游分子調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[19]，miRNA-27b 可通過作用于長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）AFAP1 反義RNA 1（AFAP1 antisense RNA 1，AFAP1-AS1）/miRNA-27b-3p/血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）信號(hào)通路調(diào)控宮頸癌干細(xì)胞的狀態(tài)[20]，miRNA-27b 可影響宮頸癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[21]。宮頸癌發(fā)生發(fā)展中一個(gè)非常重要的機(jī)制是基因調(diào)控失常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的改變、失衡，miRNA-27 與腫瘤細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系[22]。據(jù)報(bào)道，在伴有HPV16 和HPV52 感染的宮頸癌及宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者中，miRNA-27b 表達(dá)水平升高，而在伴有HPV58 感染的宮頸癌及宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者中，miRNA-27b 的表達(dá)水平下調(diào)[23]；HPV16 E7 可通過促進(jìn)miRNA-27b 表達(dá)上調(diào)，抑制下游分子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲[24]；LINC01089 可通過調(diào)控miRNA-27a抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[25]；lncRNA TOB1 反 義RNA1（TOB1 antisense RNA 1，TOB1-AS1）也可通過影響miRNA-27b 的表達(dá)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡[26]。這些研究結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞凋亡是宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制之一。

基于細(xì)胞凋亡在宮頸癌中的重要作用，了解腫瘤細(xì)胞凋亡成為研究宮頸癌的基本思路之一，但目前的研究仍未能全面闡明細(xì)胞凋亡在宮頸癌中的作用機(jī)制，尤其是miRNA-27 通過何種機(jī)制參與宮頸癌細(xì)胞凋亡目前仍未完全清楚。本研究通過Oncomir 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-27 不同的成熟體在宮頸癌中表達(dá)水平有所差異，進(jìn)一步分析其潛在的靶基因及生物學(xué)功能、信號(hào)通路等發(fā)現(xiàn)，miRNA-27 涉及復(fù)雜的生物學(xué)功能改變，其中包含細(xì)胞凋亡這一重要的生物學(xué)功能，提示宮頸癌細(xì)胞凋亡與miRNA-27 存在關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析篩查出與線粒體途徑凋亡最直接相關(guān)的靶基因，并選取與宮頸癌關(guān)系密切的LETMD1 進(jìn)行了后續(xù)驗(yàn)證。

研究表明，LETMD1在宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，是腫瘤相關(guān)基因之一[27-28]。在細(xì)胞功能方面，LETMD1是線粒體外膜的結(jié)構(gòu)蛋白組成之一[16]，因此在線粒體途徑凋亡方面具有重要作用，LETMD1 可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病2 相關(guān)X 蛋白的表達(dá)參與乳腺癌細(xì)胞凋亡[29]。同時(shí)，LETMD1 在宮頸癌中可經(jīng)由上游分子調(diào)控其表達(dá)，從而影響其功能。研究顯示，核仁小分子RNA 宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）/miRNA-194 信號(hào)通路可調(diào)控LETMD1 的表達(dá)，進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞凋亡、增殖等[30]。雖然miRNA-27 與LETMD1 均與細(xì)胞凋亡相關(guān)，但二者的關(guān)系及在宮頸癌中的作用仍有待明確，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過ENCORI 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-27 與LETMD1 存在共表達(dá)相關(guān)性，主要與miRNA-27 的成熟體miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p 相關(guān)，進(jìn)一步在宮頸癌細(xì)胞SiHa 凋亡模型中發(fā)現(xiàn)，miRNA-27a-3p、miRNA-27a-5p和LETMD1存在不同程度表達(dá)改變，順鉑組中miRNA-27a-3p 和miRNA-27a-5p相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組，LETMD1mRNA相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。提示miRNA-27 與宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的相關(guān)性與LETMD1 密切相關(guān)。究其原因，一方面LETMD1 可能是miRNA-27的潛在作用靶點(diǎn)，另一方面二者均參與宮頸癌細(xì)胞凋亡過程，因此二者的共同表達(dá)、共同作用很可能是調(diào)控宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的重要因素。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)miRNA-27 的表達(dá)、功能、潛在靶基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-27 與LETMD1 可能存在相關(guān)性，提示生物信息學(xué)分析在探索宮頸癌發(fā)病機(jī)制方面具有一定的作用，可以為后續(xù)進(jìn)一步研究提供有價(jià)值的研究方向及理論支撐，進(jìn)一步發(fā)掘更深入的機(jī)制。