楊志新，覃淑一，鄒丹，楊麗華

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650101

卵巢癌是病死率最高的婦科腫瘤，2020年全球新增卵巢癌病例31.4 萬例，病死超過20.7 萬例，病死率達(dá)60%[1]。由于缺乏有效的篩查手段，卵巢癌確診時(shí)多已進(jìn)展至晚期，5年總生存率不足50%[2]，且超過70%的晚期卵巢癌患者會出現(xiàn)化療耐藥，預(yù)后較差[3]，因此，研究卵巢癌惡性生物學(xué)行為的相關(guān)影響因子，尋找更有效的早期診斷、預(yù)后預(yù)測的方法和指標(biāo)，具有重要意義。腫瘤微環(huán)境已被證實(shí)在大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[4]。腫瘤微環(huán)境中存在多種活性細(xì)胞和活性分子，它們共同構(gòu)成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系。間質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的協(xié)同作用是腫瘤微環(huán)境的重要部分，趨化因子及其受體構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間的信號體系，是細(xì)胞遷移、趨化過程中的重要超家族。趨化因子及其受體通過抑制或刺激免疫系統(tǒng)促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展，與患者的預(yù)后密切相關(guān)[5]。免疫細(xì)胞也是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）在不同趨化因子的刺激下可極化為M1 型和M2 型，M1 型巨噬細(xì)胞為抗腫瘤巨噬細(xì)胞，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和新生血管生成；M2 型巨噬細(xì)胞為親腫瘤細(xì)胞，可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6]。中性粒細(xì)胞自身可以釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，這些細(xì)胞因子和趨化因子可以決定中性粒細(xì)胞自身的親腫瘤或抗腫瘤行為，在腫瘤微環(huán)境中呈現(xiàn)抗腫瘤性的N1 型和親腫瘤性的N2 型[7-8]。趨化因子與免疫細(xì)胞的關(guān)系復(fù)雜且緊密，探究二者之間相互影響的作用機(jī)制對研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移有重要意義。目前，包含基因表達(dá)和臨床特征的大規(guī)模公開數(shù)據(jù)為分析卵巢癌患者的預(yù)后提供了更便利的條件。本研究基于生物信息學(xué)方法分析卵巢癌患者預(yù)后的相關(guān)趨化因子，構(gòu)建多基因預(yù)后模型，并分析其與趨化因子相關(guān)的免疫細(xì)胞功能，旨在探討趨化因子在卵巢癌預(yù)后評估中的意義，為卵巢癌的診療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集及處理

從基因型-組織表達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù) 據(jù) 庫（https://www.gtexportal.org/home/）下載108 例正常卵巢組織數(shù)據(jù)及臨床資料。從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫SangerBox 界面（http://sangerbox.com/）下載379 例卵巢癌組織數(shù)據(jù)及臨床資料，其中有4 份樣本為同一卵巢癌患者取樣兩次所得，在進(jìn)行生存分析時(shí)被去除，另外3 份非原發(fā)樣本也被去除。采用R 語言載入factoextra 包對卵巢癌組織和正常卵巢組織的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）降維處理，采用sva 軟件包對數(shù)據(jù)歸一化，并對樣本進(jìn)行質(zhì)控評估及預(yù)處理。此外，從GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）收集48個(gè)以“X-C Motif Chemokine”“C-C Motif Chemokine”“C-X-C Motif Chemokine”“C-X3-C Motif Chemokine”開頭的趨化因子，進(jìn)行差異分析及后續(xù)的模型構(gòu)建。

1.2 差異趨化因子的篩選

載入經(jīng)歸一處理后的數(shù)據(jù)，采用R 語言的Limma 包比較GTEx（正常卵巢組織樣本）和TCGA（卵巢癌組織樣本）獲取樣本中差異表達(dá)的基因（篩選標(biāo) 準(zhǔn)：P≤0.05 且|log2FC|≥1），并采用R語言的pheatmap 包繪制差異基因聚類熱圖。載入所有差異表達(dá)基因及下載的趨化因子數(shù)據(jù)，利用Intersect函數(shù)分析卵巢癌中差異表達(dá)的趨化因子，結(jié)果以韋恩圖進(jìn)行展示。

1.3 預(yù)后模型的構(gòu)建與評價(jià)

通過單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選與卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)的趨化因子，采用R 語言的Survival 包的coxph 函數(shù)構(gòu)建預(yù)后模型，然后通過多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析得到最優(yōu)模型。采用Survival 包中的predict 函數(shù)計(jì)算卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)，并以此將卵巢癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，繪制Kaplan-Meier 曲線分析兩組患者的總生存期（overall survival，OS），組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估趨化因子模型對卵巢癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。

1.4 趨化因子與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性分析

在CIBERSORTx 網(wǎng)站（https://cibersort.stanford.edu/）中上傳TCGA 數(shù)據(jù)庫下載的所有卵巢癌組織樣本數(shù)據(jù)，比較高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組卵巢癌組織樣本中免疫浸潤細(xì)胞的比例，并使用R 語言Hmisc包中rcorr 函數(shù)分析建模趨化因子與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 及GTEx 數(shù)據(jù)庫組織樣本質(zhì)控

整合TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)，經(jīng)PCA 降維后的卵巢癌組織和正常卵巢組織的數(shù)據(jù)在二維主成分圖中各自聚集較好，即組內(nèi)一致性較好，且組間具有較好區(qū)分度，說明該數(shù)據(jù)可進(jìn)行后續(xù)分析。（圖1）

2.2 差異趨化因子的篩選

比較卵巢癌組織和正常卵巢組織中的基因表達(dá) 情 況，共 發(fā) 現(xiàn)6813 個(gè)差異基因（P≤0.05 且|log2FC|≥1），其中表達(dá)上調(diào)3085 個(gè)，表達(dá)下調(diào)3728個(gè)。分析6813 個(gè)差異基因與48 個(gè)趨化因子之間的基因交叉情況發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織與正常卵巢組織中存在27 個(gè)差異表達(dá)的趨化因子，分別為CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL14、CCL20、CCL21、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXC 趨化因子配體（C-X-C chemokine ligand，CXCL）1、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、XC趨化因子配體2（X-C chemokine ligand 2，XCL2）。（圖2）

圖2 正常卵巢組織和卵巢癌組織差異表達(dá)基因和趨化因子的韋恩圖

2.3 卵巢癌預(yù)后相關(guān)趨化因子挖掘

繪制Kaplan-Meier 曲線，依據(jù)趨化因子表達(dá)量中位值將372 例卵巢癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分組均為高表達(dá)組186 例，低表達(dá)組186 例。采用單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析差異表達(dá)的趨化因子與卵巢癌患者OS 的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13這6個(gè)趨化因子的表達(dá)情況與卵巢癌患者的OS 有關(guān)（P﹤0.05），趨化因子表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越好。（圖3）

圖3 各趨化因子不同表達(dá)情況卵巢癌患者的OS曲線

2.4 趨化因子相關(guān)預(yù)后模型的構(gòu)建

將卵巢癌預(yù)后相關(guān)的趨化因子CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13納入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，選取前4 個(gè)趨化因子（CXCL10、CXCL11、CXCL13和CCL25）構(gòu)建預(yù)后模型（表1），由預(yù)后模型得出生存風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)，并以此將卵巢癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=186）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=186），結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組卵巢癌患者的OS 短于低風(fēng)險(xiǎn)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）（圖4）。繪制ROC 曲線評估該模型對卵巢癌患者預(yù)后的預(yù)測效能，結(jié)果顯示，該預(yù)測模型預(yù)測卵巢癌患者1年、3年及5年預(yù)后的AUC 分別為0.563（95%CI：0.519～0.607）、0.617（95%CI：0.562～0.672）、0.653（95%CI：0.615～0.691），具有較好的預(yù)測效能（圖5）。

表1 CXCL10、CXCL11、CXCL13和CCL25預(yù)測卵巢癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸模型

圖4 高風(fēng)險(xiǎn)組（n=186）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=186）卵巢癌患者的OS曲線

圖5 趨化因子模型預(yù)測卵巢癌患者預(yù)后的ROC曲線

2.5 卵巢癌預(yù)后相關(guān)趨化因子與卵巢癌患者免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性分析

通過CIBERSORTx 網(wǎng)站分析卵巢癌組織中免疫浸潤細(xì)胞的分布情況、高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組卵巢癌患者各免疫浸潤細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組卵巢癌患者卵巢癌組織中M2 型巨噬細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例均高于低風(fēng)險(xiǎn)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。卵巢癌預(yù)后模型中CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL25的表達(dá)與M1 型巨噬細(xì)胞均呈正相關(guān)（P﹤0.05），CCL25的表達(dá)與M2 型巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P﹤0.01），CXCL13的表達(dá)與成熟樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P﹤0.01），CCL25、CXCL13的表達(dá)與中性粒細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)（P﹤0.05）。（表2）

表2 CXCL10、CXCL11、CXCL13 和CCL25 與主要免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性

3 討論

1990—2019年，中國卵巢癌發(fā)病率逐年升高，標(biāo)化發(fā)病率與粗發(fā)病率平均每年分別上升2.03%、3.85%[9]，因此，尋找有效的生物標(biāo)志物預(yù)測卵巢癌患者的預(yù)后對卵巢癌患者的治療和管理非常重要。卵巢癌的腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而趨化因子在上述過程中也發(fā)揮重要作用[10]，但目前關(guān)于趨化因子與卵巢癌患者預(yù)后關(guān)系的研究還很少。本研究基于生物信息學(xué)的方法篩選出27 個(gè)在卵巢癌組織與正常卵巢組織間差異表達(dá)的趨化因子，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中6個(gè)趨化因子與卵巢癌患者的預(yù)后有關(guān)，分別為CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11及CXCL13。

趨化因子是一類能趨化細(xì)胞定向移動的小分子分泌蛋白，與其受體共同構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)免疫細(xì)胞招募，形成免疫抑制或免疫促進(jìn)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。CCL8是趨化因子家族成員，可以在炎癥反應(yīng)和腫瘤免疫等方面發(fā)揮重要作用，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[11]。CCL25及其受體——趨化因子受體9（CC chemokine receptor 9，CCR9）能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]；CCL25高表達(dá)預(yù)示三陰性乳腺癌患者的預(yù)后良好[13]，阻斷CCR9/CCL25通路可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[14-15]。CXCL10是由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類趨化因子，其高表達(dá)與直腸癌[16]、胃癌[17]、肝細(xì)胞癌[18]等患者更好的預(yù)后相關(guān)。CXC 趨化因子受體3（CXC chemokine receptor 3，CXCR3）是CXCL10基因的唯一受體，研究表明，CXCR3 與其配體CXCL10、CXCL9 結(jié)合對高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSC）患者的預(yù)后會產(chǎn)生正向影響，是晚期HGSC的有利預(yù)后指標(biāo)[19]。CXCL11也表現(xiàn)為有利于腫瘤患者的預(yù)后，γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和TNF-α可誘導(dǎo)CXCL11和CXCL9的分泌增加，并在甲狀腺乳頭狀癌中表現(xiàn)為抗腫瘤細(xì)胞增殖作用[20]，但與卵巢癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。CXCL13已在乳腺癌[21]、結(jié)直腸癌[22]等多種實(shí)體腫瘤中證實(shí)為有利于患者的預(yù)后，CXCL13可以在HGSC 中形成免疫活性腫瘤微環(huán)境并增強(qiáng)程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）檢查點(diǎn)阻斷的效果[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11及CXCL13的表達(dá)情況與卵巢癌患者的預(yù)后有關(guān)，提示上述基因有潛力成為卵巢癌患者的預(yù)后標(biāo)志物，但其確切作用尚需進(jìn)一步進(jìn)行功能和機(jī)制研究探索。隨后本研究篩選其中4 個(gè)趨化因子構(gòu)建卵巢癌預(yù)后模型，該預(yù)測模型預(yù)測卵巢癌患者OS 的價(jià)值較高。

為了解趨化因子在卵巢癌中的作用機(jī)制，本研究分析了不同生存風(fēng)險(xiǎn)評分及建模趨化因子與腫瘤免疫浸潤細(xì)胞間的關(guān)系，結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組卵巢癌患者卵巢癌組織中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例均高于低風(fēng)險(xiǎn)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。研究表明，高密度的M2 型巨噬細(xì)胞與上皮性卵巢癌患者較差的預(yù)后和較低的總生存率有關(guān)，而高M(jìn)1/M2 型巨噬細(xì)胞比例則預(yù)示著卵巢癌患者更好的預(yù)后[24-25]。樹突狀細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的前哨細(xì)胞，通常提供常規(guī)的T 細(xì)胞刺激信號，從而激發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)[26]，人和小鼠晚期卵巢腫瘤中雖然伴有大量的成熟樹突狀細(xì)胞浸潤，且能夠表達(dá)相對較高水平的共刺激分子，但始終表現(xiàn)出抗原提呈能力缺失，最終阻斷了腫瘤內(nèi)T 細(xì)胞的局部活化和擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[27]。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-tolymphocyte ratio，NLR）是腫瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。劉楠等[28]發(fā)現(xiàn)，高NLR 水平卵巢癌患者的OS 較短，且高NLR 與卵巢癌患者國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期晚、腹腔積液及化療敏感性降低有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL25的表達(dá)與M1 型巨噬細(xì)胞均呈正相關(guān)（P﹤0.05），CCL25的表達(dá)與M2 型巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P﹤0.01），CXCL13的表達(dá)與成熟樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P﹤0.01），CCL25、CXCL13的表達(dá)與中性粒細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)（P﹤0.05）。提示卵巢癌微環(huán)境中趨化因子CXCL11、CXCL13、CCL25可能介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫浸潤細(xì)胞的數(shù)量增加，從而提高了抗腫瘤免疫效應(yīng)，解除免疫抑制，減緩卵巢癌進(jìn)展，有利于卵巢癌患者的預(yù)后。

綜上所述，基于生物信息學(xué)方法篩選趨化因子構(gòu)建卵巢癌患者預(yù)后的多因素Cox 回歸模型，并發(fā)現(xiàn)CXCL10、CXCL11、CXCL13和CCL25這4 個(gè)趨化因子與免疫浸潤細(xì)胞有關(guān)，有助于對卵巢癌患者進(jìn)行分層并預(yù)測其預(yù)后生存情況，為卵巢癌的后續(xù)研究提供了新見解。