宋恭帥 王丹麗 袁婷蘭 李 玲 龔金炎

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

烏鱧（Channa argus），俗稱黑魚、烏魚等，鱸形目鱧科鱧屬。烏鱧體色呈黑色，體側(cè)有不規(guī)則黑斑，廣泛分布于我國各大水系，是常見的淡水食用魚［1］。烏鱧營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的鈣、鐵等微量元素，且蛋白、脂肪含量高，具有較高的藥用和食用價(jià)值［1-2］。烏鱧因刺少、采肉率高且肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美而深受消費(fèi)者喜愛，具有滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)、祛風(fēng)治疳、生肌補(bǔ)血、促進(jìn)傷口愈合等功效［3-4］。吳小東［5］研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧魚膽中的牛黃膽酸鈉和牛黃鵝去氧膽酸鈉具有一定的抗炎活性。周朝偉等［6］通過對(duì)烏鱧進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析，證明了其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但作為一種經(jīng)濟(jì)魚類，烏鱧各個(gè)部位在實(shí)際生產(chǎn)開發(fā)中均會(huì)產(chǎn)生不同程度的腥臭味，影響了其利用價(jià)值。

國內(nèi)外對(duì)于烏鱧不同部位揮發(fā)性成分的研究較少，相關(guān)研究主要集中于魚肉保鮮［1，7］和高效養(yǎng)殖技術(shù)［8］方面。戶帥鋒等［7］以殼聚糖、山梨酸-殼聚糖微囊粉末及山梨酸為抗菌物質(zhì)，制備出復(fù)合抗菌薄膜，延長(zhǎng)了烏鱧貨架期。馬文慧等［4］分析測(cè)定了烏鱧魚片在貯藏過程中的品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)低溫處理能減緩凍藏過程中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)劣變。吳紅霞［8］從多方面探討了烏鱧的養(yǎng)殖條件，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)養(yǎng)殖技術(shù)相比，綜合養(yǎng)殖技術(shù)的應(yīng)用使烏鱧增產(chǎn)增效達(dá)30%。烏鱧不同部位揮發(fā)性成分會(huì)影響其利用價(jià)值，故需研究各部位揮發(fā)性成分的差異。

揮發(fā)性成分的分析包括成分收集與分析，目前較為常用的收集方法是頂空固相微萃取法（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）［9］。然而傳統(tǒng)的HS-SPME 主要采用熱輔助解吸（heat assisted desorption，HAD），存在萃取時(shí)間較長(zhǎng)、萃取頭使用壽命短等問題［10］。激光作為一種高質(zhì)量的光源，因具有較好的方向性、單色性、相干性及亮度等特性而被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究［11］。激光可有效促進(jìn)樣品中揮發(fā)性成分的快速釋放，極大縮短了揮發(fā)性物質(zhì)的釋放時(shí)間，從而有效提高了揮發(fā)性成分的萃取效率［12-13］。Song 等［12-13］建立了一種新型的激光照射解吸（laser irradiation desorption，LID）技術(shù)以取代HAD，使樣品中揮發(fā)性成分在較短時(shí)間內(nèi)獲得釋放，整個(gè)分析過程高效、簡(jiǎn)便且成本較低。因此，本研究采用新型的LID技術(shù)進(jìn)行解吸，并進(jìn)一步通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）分析鑒定烏鱧不同部位的揮發(fā)性成分，根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)得到區(qū)分不同部位的重要成分，旨在為烏鱧的腥味研究和有效利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

烏鱧，由浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Trace DSQ Ⅱ 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭（50/30 μm），美國Supelco 公司；二極管激光器（最大允許輸出功率為50 W，最長(zhǎng)工作波長(zhǎng)為450 nm），長(zhǎng)春鐳仕光電科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 用220 V 的電壓將3 條體長(zhǎng)（約25 cm）、體重（約2 000 g）大致相同的鮮活烏鱧電擊至?xí)灒玫度?nèi)臟和鰓，剝皮、取肉。分別從3條烏鱧身上各取內(nèi)臟、鰓、肌肉和皮膚10 g 分裝入頂空瓶中，置于-4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 感官評(píng)定 隨機(jī)選取20 名經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)的評(píng)估人員（男女性人數(shù)相同）對(duì)不同部位的烏鱧樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。根據(jù)樣品特性確定5 種感官指標(biāo)，包括油脂味、青草味、堅(jiān)果味、土腥味和魚腥味，并根據(jù)氣味強(qiáng)弱進(jìn)行打分評(píng)定［12］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)從很弱（-2 分）依次遞增至很強(qiáng)，共五個(gè)等級(jí)（-2、-1、0、1、2）。

1.3.3 頂空固相微萃取條件 將老化好的萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空部分約2 mm，萃取溫度約50 ℃，待吸附完成后，取出萃取頭并立即插入GC 進(jìn)樣口，于250 ℃條件下解吸3 min。

利用二極管激光器對(duì)烏鱧樣品進(jìn)行照射，并分析激光照射功率、樣品添加量與照射時(shí)間3 個(gè)單因素對(duì)烏鱧樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

1.3.4 GC/MS 檢測(cè)條件 GC 條件：HP-88 毛細(xì)管色譜柱（30 m × 0.25 mm，0.20 μm）；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；升溫程序：起始柱溫70 ℃，保持1 min，以4 ℃·min-1的速度升至180 ℃，保持5 min；再以3 ℃·min-1的速度升至230 ℃，保持5 min。

MS 條件：電子離子源溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。

1.3.5 化合物定性分析 選取常見的己醛、1-戊烯-3-醇、壬醛等10 種標(biāo)準(zhǔn)品，基于保留指數(shù)和特征離子碎片等進(jìn)行烏鱧樣品中揮發(fā)性成分的定性分析，剩余揮發(fā)性成分則通過相關(guān)譜庫（FFNSC1.3、NIST11s和NIST11）進(jìn)行相似度檢索，并以正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算剩余揮發(fā)性成分的保留指數(shù)［14-16］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品重復(fù)測(cè)試3 次，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)定結(jié)果

圖1 為烏鱧內(nèi)臟、肌肉、皮及鰓4 個(gè)不同部位的特征氣味差異雷達(dá)圖。結(jié)果表明，烏鱧不同部位的氣味差異較為明顯。肌肉與鰓中魚腥味、油脂味和土腥味最強(qiáng)，這可能與烏鱧生活的環(huán)境有關(guān)。此外，在4 個(gè)部位中都含有較強(qiáng)的土腥味，這可能是由于烏鱧通過食物鏈攝入附有含土腥味細(xì)菌的藍(lán)藻、硅藻等浮游生物及部分水草。相比之下，內(nèi)臟和皮中油脂味最弱，主要是由于這兩個(gè)部位的組織結(jié)構(gòu)較為緊密，導(dǎo)致游離脂質(zhì)的含量較少。

圖1 烏鱧不同部位感官評(píng)分雷達(dá)圖Fig.1 The radar chart of organoleptic scores for different parts of snakehead

2.2 激光照射條件對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的影響

激光能量的強(qiáng)弱與其照射功率的大小有關(guān)［14］。如圖2-A 所示，隨著照射功率的升高，己醛、己醇、1-辛烯-3-醇和壬醛的峰面積均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)照射功率為10 W 時(shí)，4 種特征揮發(fā)性成分的峰面積最大，說明該條件下的萃取效果最佳。功率過低時(shí)，內(nèi)臟表面的溫度較低，其揮發(fā)性成分不能完全揮發(fā)出來；功率過高時(shí)，導(dǎo)致表面溫度過高，易使內(nèi)臟發(fā)生化學(xué)變化而產(chǎn)生新的揮發(fā)性物質(zhì)，故選擇10 W 為最佳激光照射功率。

圖2 照射功率（A）、樣品添加量（B）及照射時(shí)間（C）對(duì)揮發(fā)性成分萃取率的影響Fig.2 Effect of irradiation power （A），sample volume （B） and irradiation time （C） on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

在相同照射功率下，樣品添加量越大，升溫速率越慢，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分不易揮發(fā)。由圖2-B可知，在添加量為2～3 g時(shí)，樣品中揮發(fā)性成分的峰面積均隨添加量的增加而增大，添加量為3 g 時(shí)，各物質(zhì)峰面積最大。之后，隨著樣品添加量的增加，各物質(zhì)的峰面積均逐漸減小。因此，最佳樣品添加量為3 g。

在相同激光照射功率及樣品添加量下，照射時(shí)間越長(zhǎng)，溫度變化越明顯。由圖2-C 可知，4 種特征揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積受照射時(shí)間影響較大。在3～5 min時(shí)，峰面積均隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，5 min 時(shí)各物質(zhì)峰面積達(dá)到最大值，故選擇5 min 為最佳照射時(shí)間。

2.3 烏鱧不同部位揮發(fā)性成分分析

采用LID-HS-SPME-GC/MS 分別對(duì)烏鱧的內(nèi)臟、鰓、肌肉和皮4 個(gè)部位進(jìn)行揮發(fā)性成分的測(cè)定和分析，結(jié)果如表1 所示。4 個(gè)樣品中共檢出40 種揮發(fā)性成分，包括醛類13種、醇類7種、酮類2種、烴類7種、酯類2 種以及其他類9 種，其中17 種成分為4 個(gè)部位共有。由表1 還可以看出，烏鱧不同部位揮發(fā)性成分的種類和含量均有明顯差異。

表1 烏鱧內(nèi)臟、肌肉、皮和鰓的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of viscera，muscles，skin and gills of snakehead

醛類物質(zhì)主要來源于不飽和脂肪酸的分解，感覺閾值相比其他物質(zhì)低，即使微量也會(huì)對(duì)整體的氣味產(chǎn)生一定的影響，具有脂肪味、魚腥味、青草味等［17］。烏鱧體內(nèi)共檢出13 種醛類物質(zhì)，其中內(nèi)臟10 種、肌肉10 種、皮9 種、鰓9 種。己醛和壬醛是含量最高的兩種物質(zhì)，分別貢獻(xiàn)魚腥味、青草味和脂肪味、魚腥味、清香味，是烏鱧體內(nèi)腥味的主要來源。己醛在肌肉中含量最高，為15.45 μg·kg-1；而壬醛在皮中的含量最高，為18.52 μg·kg-1，內(nèi)臟中最低，僅為0.83 μg·kg-1。4 個(gè)部位中，肌肉和皮的醛類物質(zhì)總含量較高，分別為33.64 和37.55 μg·kg-1，說明醛類對(duì)肌肉和皮氣味形成影響較大，可能是其腥臭味的主要來源［18-19］。

醇類物質(zhì)一般由羰基化合物還原產(chǎn)生，可分為飽和醇與不飽和醇。不飽和醇的感覺閾值更低，對(duì)整體氣味的影響更大［20-21］。烏鱧體內(nèi)共檢出7 種醇類物質(zhì)，其中1-辛烯-3-醇是共有且含量最高的物質(zhì)，在內(nèi)臟、肌肉、皮、鰓中的相對(duì)含量分別為5.58、9.65、7.84、17.36 μg·kg-1，具有令人不愉快的土腥味；且醇類物質(zhì)在鰓中的總含量最高（24.90 μg·kg-1），對(duì)鰓氣味的形成影響較大。土腥味是影響烏鱧口感的一個(gè)關(guān)鍵因素，而醇類物質(zhì)是水產(chǎn)品中泥土味或者類似金屬味的主要來源［22-24］。

烴類物質(zhì)在烏鱧體內(nèi)檢出量較低但種類豐富，共有7種，其中乙苯、對(duì)二甲苯和2，6，10-三甲基-十六烷為4 個(gè)部位所共有。烴類主要是由脂肪酸烷基自由基的均裂產(chǎn)生，普遍閾值高，對(duì)烏鱧腥味的直接貢獻(xiàn)不大。但烯烴類在一些特定條件下會(huì)形成酮、醛，因此對(duì)大烏鱧腥味存在潛在影響［25］。另外，酮類、酯類物質(zhì)種類少且相對(duì)含量較低，對(duì)整體的氣味影響不大。其他類中有幾種胺類物質(zhì)，一般來說具有臭味，對(duì)烏鱧腥味特征的形成有一定貢獻(xiàn)［26］。

2.4 主成分分析

主成分分析（PCA）是多變量數(shù)據(jù)分析常用的方法，目的是了解觀測(cè)變量之間的相似性或差異性，為進(jìn)一步分析提供參考［27-28］。本研究利用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA，對(duì)烏鱧4 個(gè)部位的共計(jì)40 種揮發(fā)性成分進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，取2個(gè)主成分，得到二維平面圖如圖3-A 所示（J 表示肌肉、N 表示內(nèi)臟、P 表示皮、S 表示鰓）。第1主成分對(duì)解釋變量的貢獻(xiàn)最大，貢獻(xiàn)率為47.80%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為27.70%。擬合度（R2）和預(yù)測(cè)能力（Q2）可用來評(píng)價(jià)模型的有效性［29］。通過計(jì)算可知，該模型的R2為92.30%，Q2為89.20%（大于50%），說明其具有良好的可靠性和預(yù)測(cè)性。36個(gè)烏鱧樣品被分為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的集群，即肌肉、內(nèi)臟、皮和鰓，分布在不同區(qū)域。肌肉、內(nèi)臟和其他兩個(gè)樣品明顯區(qū)分開，皮和鰓之間的距離相對(duì)較近，說明烏鱧不同部位的檢測(cè)變量（揮發(fā)性成分）存在一定差異性，而四組觀測(cè)變量之間的距離也反映了觀測(cè)變量或檢測(cè)變量的差異和相似程度。

圖3 多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Multivariate statistical analysis

圖3-B 為主成分載荷散點(diǎn)圖，在置信區(qū)間為95%的情況下，第1主成分中甲氧基苯肟、3，5，5-三甲基-2-己烯、苯甲醛、3-甲硫基-丙醛等揮發(fā)性成分所占比重較大，說明這些變量對(duì)于形成第1主成分的貢獻(xiàn)較大，結(jié)合表1表明這些物質(zhì)在區(qū)分樣品中起到重要作用；同理，第2 主成分中4-甲基-5-癸醇、2-戊基呋喃、十二醛、己醛、戊醛等揮發(fā)性成分作用較大。PCA 距離圖（DModX）表示訓(xùn)練集中的一個(gè)觀測(cè)值到模型平面或超平面的距離，與觀測(cè)值的剩余標(biāo)準(zhǔn)差成正比。DModX臨界值是由F分布計(jì)算而來，若觀測(cè)值是臨界值的2倍或以上，則認(rèn)為是異常值。由圖3-C可知，本試驗(yàn)所有觀測(cè)值均在臨界值以下，說明模型中數(shù)據(jù)有效可靠，不存在異常值，可進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。

2.5 正交偏最小二乘判別分析

為確定烏鱧不同部位的特征氣味物質(zhì)，本研究在PCA 基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。OPLS-DA 是不同于PCA 的一種有監(jiān)督作用的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，與偏最小二乘判別分析（partial least-square discriminant analysis，PLS-DA）相比，OPLS-DA 觀測(cè)變量矩陣中與預(yù)測(cè)變量矩陣中無關(guān)聯(lián)的“噪音”變量會(huì)被濾除，可更好地解釋觀測(cè)值并有效實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)變量的預(yù)測(cè)［30-31］。

對(duì)烏鱧4 個(gè)不同部位的36 個(gè)觀測(cè)變量和40 個(gè)檢測(cè)變量進(jìn)行OPLS-DA 分析，累計(jì)R2X為95.50%，累計(jì)R2Y為97.80%，均接近于100%，且累計(jì)Q2為97.40%（大于50%），說明模型的擬合度和預(yù)測(cè)性較好。變量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）圖可總結(jié)各個(gè)變量的重要程度，一般地，VIP 值大于1的變量稱為重要變量，而小于0.5的則為不重要變量，介于1 和0.5 之間的為灰色區(qū)域［32］。圖3-D 中將各個(gè)變量的VIP 值從大到小進(jìn)行了排列，共有7 個(gè)變量的VIP 值≥1，分別為壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙烯基酯、2-（氮雜環(huán)丙烷-1-基）乙胺、辛醛、3，5，5-三甲基-2-己烯。壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇是排列前三的揮發(fā)性成分，與表1中的分析結(jié)果一致，說明這3 種物質(zhì)是判別烏鱧不同部位的重要特征氣味物質(zhì)，貢獻(xiàn)了魚腥味、青草味、脂肪味、油膩味、土腥味、蘑菇味等氣味特征，是烏鱧腥臭味的主要來源。

3 討論

水產(chǎn)動(dòng)物中腥味物質(zhì)的組成較為復(fù)雜，同一種原料不同部位的腥味組成會(huì)存在差異。本研究表明，烏鱧魚皮中腥味物質(zhì)最多，而肌肉中相對(duì)較少，主要與魚類自身結(jié)構(gòu)及生活環(huán)境有關(guān)，這與王國超等［33］報(bào)道的結(jié)果相一致。脂肪含量較高的魚體中往往含有更多的腥味物質(zhì)，這是由于脂肪分解后易產(chǎn)生酮、醛類等揮發(fā)性物質(zhì)。而脂肪分解所需的酶類及微生物更多地存在于魚皮及內(nèi)臟中。淡水魚中含有較強(qiáng)的土臭味與泥土味，此外，水體中的某些藻類及放線菌又會(huì)加重魚體中的腥味。而這些腥味物質(zhì)往往是先進(jìn)入魚體內(nèi)臟，再進(jìn)入肌肉組織中。

目前，水產(chǎn)動(dòng)物中腥味物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法主要包括感官評(píng)價(jià)及儀器檢測(cè)分析。感官評(píng)定是最方便、最直接的方法，但一般需要專業(yè)的感官評(píng)定者完成，其結(jié)果存在一定的主觀性。儀器檢測(cè)分析方法則是利用前處理技術(shù)與色譜質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中揮發(fā)性成分的分析，其中HS-SPME-GC/MS 技術(shù)是最為常用的儀器分析方法。作者前期利用傳統(tǒng)的HS-SPMEGC/MS 測(cè)定了5 種不同提取方法制備的甲魚油中的揮發(fā)性成分，結(jié)果表明，需在60 ℃條件下吸附30 min，前處理時(shí)間較長(zhǎng)［17］。而本試驗(yàn)采用激光照射促釋技術(shù)僅需5 min，且離子強(qiáng)度相差不大，證明新型激光促釋技術(shù)結(jié)合固相微萃取能快速有效地測(cè)定烏鱧不同部位的揮發(fā)性成分。后續(xù)研究可嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于更多不同的樣品中。

4 結(jié)論

烏鱧4 個(gè)部位的揮發(fā)性成分種類和含量都有明顯不同，尤其是呈現(xiàn)魚腥味、土腥味的壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇在4 個(gè)部位的含量差異較大。PCA 發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)部位能明顯區(qū)分開，且模型中的數(shù)據(jù)有效可靠，沒有異常值，并證明了4 種樣品間有明顯差異；OPLS-DA 確定了壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇為判別4 個(gè)部位最主要的氣味物質(zhì)，貢獻(xiàn)了魚腥味、青草味、脂肪味、油膩味、土腥味、蘑菇味等，是烏鱧特征氣味的主要來源。