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        基于激光促釋固相微萃取分析烏鱧不同部位揮發(fā)性成分

        2023-06-05 06:23:58宋恭帥王丹麗袁婷蘭龔金炎
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2023年7期

        宋恭帥 王丹麗 袁婷蘭 李 玲 龔金炎

        (浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310023)

        烏鱧(Channa argus),俗稱黑魚、烏魚等,鱸形目鱧科鱧屬。烏鱧體色呈黑色,體側(cè)有不規(guī)則黑斑,廣泛分布于我國各大水系,是常見的淡水食用魚[1]。烏鱧營(yíng)養(yǎng)豐富,含有人體所需的鈣、鐵等微量元素,且蛋白、脂肪含量高,具有較高的藥用和食用價(jià)值[1-2]。烏鱧因刺少、采肉率高且肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美而深受消費(fèi)者喜愛,具有滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)、祛風(fēng)治疳、生肌補(bǔ)血、促進(jìn)傷口愈合等功效[3-4]。吳小東[5]研究發(fā)現(xiàn),烏鱧魚膽中的牛黃膽酸鈉和牛黃鵝去氧膽酸鈉具有一定的抗炎活性。周朝偉等[6]通過對(duì)烏鱧進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析,證明了其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但作為一種經(jīng)濟(jì)魚類,烏鱧各個(gè)部位在實(shí)際生產(chǎn)開發(fā)中均會(huì)產(chǎn)生不同程度的腥臭味,影響了其利用價(jià)值。

        國內(nèi)外對(duì)于烏鱧不同部位揮發(fā)性成分的研究較少,相關(guān)研究主要集中于魚肉保鮮[1,7]和高效養(yǎng)殖技術(shù)[8]方面。戶帥鋒等[7]以殼聚糖、山梨酸-殼聚糖微囊粉末及山梨酸為抗菌物質(zhì),制備出復(fù)合抗菌薄膜,延長(zhǎng)了烏鱧貨架期。馬文慧等[4]分析測(cè)定了烏鱧魚片在貯藏過程中的品質(zhì)變化,發(fā)現(xiàn)低溫處理能減緩凍藏過程中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)劣變。吳紅霞[8]從多方面探討了烏鱧的養(yǎng)殖條件,發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)養(yǎng)殖技術(shù)相比,綜合養(yǎng)殖技術(shù)的應(yīng)用使烏鱧增產(chǎn)增效達(dá)30%。烏鱧不同部位揮發(fā)性成分會(huì)影響其利用價(jià)值,故需研究各部位揮發(fā)性成分的差異。

        揮發(fā)性成分的分析包括成分收集與分析,目前較為常用的收集方法是頂空固相微萃取法(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)[9]。然而傳統(tǒng)的HS-SPME 主要采用熱輔助解吸(heat assisted desorption,HAD),存在萃取時(shí)間較長(zhǎng)、萃取頭使用壽命短等問題[10]。激光作為一種高質(zhì)量的光源,因具有較好的方向性、單色性、相干性及亮度等特性而被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究[11]。激光可有效促進(jìn)樣品中揮發(fā)性成分的快速釋放,極大縮短了揮發(fā)性物質(zhì)的釋放時(shí)間,從而有效提高了揮發(fā)性成分的萃取效率[12-13]。Song 等[12-13]建立了一種新型的激光照射解吸(laser irradiation desorption,LID)技術(shù)以取代HAD,使樣品中揮發(fā)性成分在較短時(shí)間內(nèi)獲得釋放,整個(gè)分析過程高效、簡(jiǎn)便且成本較低。因此,本研究采用新型的LID技術(shù)進(jìn)行解吸,并進(jìn)一步通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry,HS-SPME-GC/MS)分析鑒定烏鱧不同部位的揮發(fā)性成分,根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)得到區(qū)分不同部位的重要成分,旨在為烏鱧的腥味研究和有效利用提供科學(xué)參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        烏鱧,由浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心提供。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Thermo Trace DSQ Ⅱ 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Thermo Fisher Scientific 公司;二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭(50/30 μm),美國Supelco 公司;二極管激光器(最大允許輸出功率為50 W,最長(zhǎng)工作波長(zhǎng)為450 nm),長(zhǎng)春鐳仕光電科技有限公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 樣品制備 用220 V 的電壓將3 條體長(zhǎng)(約25 cm)、體重(約2 000 g)大致相同的鮮活烏鱧電擊至?xí)灒玫度?nèi)臟和鰓,剝皮、取肉。分別從3條烏鱧身上各取內(nèi)臟、鰓、肌肉和皮膚10 g 分裝入頂空瓶中,置于-4 ℃冰箱冷藏備用。

        1.3.2 感官評(píng)定 隨機(jī)選取20 名經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)的評(píng)估人員(男女性人數(shù)相同)對(duì)不同部位的烏鱧樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。根據(jù)樣品特性確定5 種感官指標(biāo),包括油脂味、青草味、堅(jiān)果味、土腥味和魚腥味,并根據(jù)氣味強(qiáng)弱進(jìn)行打分評(píng)定[12]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)從很弱(-2 分)依次遞增至很強(qiáng),共五個(gè)等級(jí)(-2、-1、0、1、2)。

        1.3.3 頂空固相微萃取條件 將老化好的萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空部分約2 mm,萃取溫度約50 ℃,待吸附完成后,取出萃取頭并立即插入GC 進(jìn)樣口,于250 ℃條件下解吸3 min。

        利用二極管激光器對(duì)烏鱧樣品進(jìn)行照射,并分析激光照射功率、樣品添加量與照射時(shí)間3 個(gè)單因素對(duì)烏鱧樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

        1.3.4 GC/MS 檢測(cè)條件 GC 條件:HP-88 毛細(xì)管色譜柱(30 m × 0.25 mm,0.20 μm);不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:高純氦氣;升溫程序:起始柱溫70 ℃,保持1 min,以4 ℃·min-1的速度升至180 ℃,保持5 min;再以3 ℃·min-1的速度升至230 ℃,保持5 min。

        MS 條件:電子離子源溫度200 ℃;檢測(cè)器溫度280 ℃;傳輸線溫度250 ℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z30~500。

        1.3.5 化合物定性分析 選取常見的己醛、1-戊烯-3-醇、壬醛等10 種標(biāo)準(zhǔn)品,基于保留指數(shù)和特征離子碎片等進(jìn)行烏鱧樣品中揮發(fā)性成分的定性分析,剩余揮發(fā)性成分則通過相關(guān)譜庫(FFNSC1.3、NIST11s和NIST11)進(jìn)行相似度檢索,并以正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為基準(zhǔn),計(jì)算剩余揮發(fā)性成分的保留指數(shù)[14-16]。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        每組樣品重復(fù)測(cè)試3 次,所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,并采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量統(tǒng)計(jì)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 感官評(píng)定結(jié)果

        圖1 為烏鱧內(nèi)臟、肌肉、皮及鰓4 個(gè)不同部位的特征氣味差異雷達(dá)圖。結(jié)果表明,烏鱧不同部位的氣味差異較為明顯。肌肉與鰓中魚腥味、油脂味和土腥味最強(qiáng),這可能與烏鱧生活的環(huán)境有關(guān)。此外,在4 個(gè)部位中都含有較強(qiáng)的土腥味,這可能是由于烏鱧通過食物鏈攝入附有含土腥味細(xì)菌的藍(lán)藻、硅藻等浮游生物及部分水草。相比之下,內(nèi)臟和皮中油脂味最弱,主要是由于這兩個(gè)部位的組織結(jié)構(gòu)較為緊密,導(dǎo)致游離脂質(zhì)的含量較少。

        圖1 烏鱧不同部位感官評(píng)分雷達(dá)圖Fig.1 The radar chart of organoleptic scores for different parts of snakehead

        2.2 激光照射條件對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的影響

        激光能量的強(qiáng)弱與其照射功率的大小有關(guān)[14]。如圖2-A 所示,隨著照射功率的升高,己醛、己醇、1-辛烯-3-醇和壬醛的峰面積均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)照射功率為10 W 時(shí),4 種特征揮發(fā)性成分的峰面積最大,說明該條件下的萃取效果最佳。功率過低時(shí),內(nèi)臟表面的溫度較低,其揮發(fā)性成分不能完全揮發(fā)出來;功率過高時(shí),導(dǎo)致表面溫度過高,易使內(nèi)臟發(fā)生化學(xué)變化而產(chǎn)生新的揮發(fā)性物質(zhì),故選擇10 W 為最佳激光照射功率。

        圖2 照射功率(A)、樣品添加量(B)及照射時(shí)間(C)對(duì)揮發(fā)性成分萃取率的影響Fig.2 Effect of irradiation power (A),sample volume (B) and irradiation time (C) on the extraction efficiency of the selected characteristic compounds

        在相同照射功率下,樣品添加量越大,升溫速率越慢,從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分不易揮發(fā)。由圖2-B可知,在添加量為2~3 g時(shí),樣品中揮發(fā)性成分的峰面積均隨添加量的增加而增大,添加量為3 g 時(shí),各物質(zhì)峰面積最大。之后,隨著樣品添加量的增加,各物質(zhì)的峰面積均逐漸減小。因此,最佳樣品添加量為3 g。

        在相同激光照射功率及樣品添加量下,照射時(shí)間越長(zhǎng),溫度變化越明顯。由圖2-C 可知,4 種特征揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積受照射時(shí)間影響較大。在3~5 min時(shí),峰面積均隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,5 min 時(shí)各物質(zhì)峰面積達(dá)到最大值,故選擇5 min 為最佳照射時(shí)間。

        2.3 烏鱧不同部位揮發(fā)性成分分析

        采用LID-HS-SPME-GC/MS 分別對(duì)烏鱧的內(nèi)臟、鰓、肌肉和皮4 個(gè)部位進(jìn)行揮發(fā)性成分的測(cè)定和分析,結(jié)果如表1 所示。4 個(gè)樣品中共檢出40 種揮發(fā)性成分,包括醛類13種、醇類7種、酮類2種、烴類7種、酯類2 種以及其他類9 種,其中17 種成分為4 個(gè)部位共有。由表1 還可以看出,烏鱧不同部位揮發(fā)性成分的種類和含量均有明顯差異。

        表1 烏鱧內(nèi)臟、肌肉、皮和鰓的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of viscera,muscles,skin and gills of snakehead

        醛類物質(zhì)主要來源于不飽和脂肪酸的分解,感覺閾值相比其他物質(zhì)低,即使微量也會(huì)對(duì)整體的氣味產(chǎn)生一定的影響,具有脂肪味、魚腥味、青草味等[17]。烏鱧體內(nèi)共檢出13 種醛類物質(zhì),其中內(nèi)臟10 種、肌肉10 種、皮9 種、鰓9 種。己醛和壬醛是含量最高的兩種物質(zhì),分別貢獻(xiàn)魚腥味、青草味和脂肪味、魚腥味、清香味,是烏鱧體內(nèi)腥味的主要來源。己醛在肌肉中含量最高,為15.45 μg·kg-1;而壬醛在皮中的含量最高,為18.52 μg·kg-1,內(nèi)臟中最低,僅為0.83 μg·kg-1。4 個(gè)部位中,肌肉和皮的醛類物質(zhì)總含量較高,分別為33.64 和37.55 μg·kg-1,說明醛類對(duì)肌肉和皮氣味形成影響較大,可能是其腥臭味的主要來源[18-19]。

        醇類物質(zhì)一般由羰基化合物還原產(chǎn)生,可分為飽和醇與不飽和醇。不飽和醇的感覺閾值更低,對(duì)整體氣味的影響更大[20-21]。烏鱧體內(nèi)共檢出7 種醇類物質(zhì),其中1-辛烯-3-醇是共有且含量最高的物質(zhì),在內(nèi)臟、肌肉、皮、鰓中的相對(duì)含量分別為5.58、9.65、7.84、17.36 μg·kg-1,具有令人不愉快的土腥味;且醇類物質(zhì)在鰓中的總含量最高(24.90 μg·kg-1),對(duì)鰓氣味的形成影響較大。土腥味是影響烏鱧口感的一個(gè)關(guān)鍵因素,而醇類物質(zhì)是水產(chǎn)品中泥土味或者類似金屬味的主要來源[22-24]。

        烴類物質(zhì)在烏鱧體內(nèi)檢出量較低但種類豐富,共有7種,其中乙苯、對(duì)二甲苯和2,6,10-三甲基-十六烷為4 個(gè)部位所共有。烴類主要是由脂肪酸烷基自由基的均裂產(chǎn)生,普遍閾值高,對(duì)烏鱧腥味的直接貢獻(xiàn)不大。但烯烴類在一些特定條件下會(huì)形成酮、醛,因此對(duì)大烏鱧腥味存在潛在影響[25]。另外,酮類、酯類物質(zhì)種類少且相對(duì)含量較低,對(duì)整體的氣味影響不大。其他類中有幾種胺類物質(zhì),一般來說具有臭味,對(duì)烏鱧腥味特征的形成有一定貢獻(xiàn)[26]。

        2.4 主成分分析

        主成分分析(PCA)是多變量數(shù)據(jù)分析常用的方法,目的是了解觀測(cè)變量之間的相似性或差異性,為進(jìn)一步分析提供參考[27-28]。本研究利用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA,對(duì)烏鱧4 個(gè)部位的共計(jì)40 種揮發(fā)性成分進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維,取2個(gè)主成分,得到二維平面圖如圖3-A 所示(J 表示肌肉、N 表示內(nèi)臟、P 表示皮、S 表示鰓)。第1主成分對(duì)解釋變量的貢獻(xiàn)最大,貢獻(xiàn)率為47.80%,第2主成分的貢獻(xiàn)率為27.70%。擬合度(R2)和預(yù)測(cè)能力(Q2)可用來評(píng)價(jià)模型的有效性[29]。通過計(jì)算可知,該模型的R2為92.30%,Q2為89.20%(大于50%),說明其具有良好的可靠性和預(yù)測(cè)性。36個(gè)烏鱧樣品被分為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的集群,即肌肉、內(nèi)臟、皮和鰓,分布在不同區(qū)域。肌肉、內(nèi)臟和其他兩個(gè)樣品明顯區(qū)分開,皮和鰓之間的距離相對(duì)較近,說明烏鱧不同部位的檢測(cè)變量(揮發(fā)性成分)存在一定差異性,而四組觀測(cè)變量之間的距離也反映了觀測(cè)變量或檢測(cè)變量的差異和相似程度。

        圖3 多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Multivariate statistical analysis

        圖3-B 為主成分載荷散點(diǎn)圖,在置信區(qū)間為95%的情況下,第1主成分中甲氧基苯肟、3,5,5-三甲基-2-己烯、苯甲醛、3-甲硫基-丙醛等揮發(fā)性成分所占比重較大,說明這些變量對(duì)于形成第1主成分的貢獻(xiàn)較大,結(jié)合表1表明這些物質(zhì)在區(qū)分樣品中起到重要作用;同理,第2 主成分中4-甲基-5-癸醇、2-戊基呋喃、十二醛、己醛、戊醛等揮發(fā)性成分作用較大。PCA 距離圖(DModX)表示訓(xùn)練集中的一個(gè)觀測(cè)值到模型平面或超平面的距離,與觀測(cè)值的剩余標(biāo)準(zhǔn)差成正比。DModX臨界值是由F分布計(jì)算而來,若觀測(cè)值是臨界值的2倍或以上,則認(rèn)為是異常值。由圖3-C可知,本試驗(yàn)所有觀測(cè)值均在臨界值以下,說明模型中數(shù)據(jù)有效可靠,不存在異常值,可進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。

        2.5 正交偏最小二乘判別分析

        為確定烏鱧不同部位的特征氣味物質(zhì),本研究在PCA 基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。OPLS-DA 是不同于PCA 的一種有監(jiān)督作用的判別分析統(tǒng)計(jì)方法,與偏最小二乘判別分析(partial least-square discriminant analysis,PLS-DA)相比,OPLS-DA 觀測(cè)變量矩陣中與預(yù)測(cè)變量矩陣中無關(guān)聯(lián)的“噪音”變量會(huì)被濾除,可更好地解釋觀測(cè)值并有效實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)變量的預(yù)測(cè)[30-31]。

        對(duì)烏鱧4 個(gè)不同部位的36 個(gè)觀測(cè)變量和40 個(gè)檢測(cè)變量進(jìn)行OPLS-DA 分析,累計(jì)R2X為95.50%,累計(jì)R2Y為97.80%,均接近于100%,且累計(jì)Q2為97.40%(大于50%),說明模型的擬合度和預(yù)測(cè)性較好。變量重要性投影值(variable importance for the projection,VIP)圖可總結(jié)各個(gè)變量的重要程度,一般地,VIP 值大于1的變量稱為重要變量,而小于0.5的則為不重要變量,介于1 和0.5 之間的為灰色區(qū)域[32]。圖3-D 中將各個(gè)變量的VIP 值從大到小進(jìn)行了排列,共有7 個(gè)變量的VIP 值≥1,分別為壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙烯基酯、2-(氮雜環(huán)丙烷-1-基)乙胺、辛醛、3,5,5-三甲基-2-己烯。壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇是排列前三的揮發(fā)性成分,與表1中的分析結(jié)果一致,說明這3 種物質(zhì)是判別烏鱧不同部位的重要特征氣味物質(zhì),貢獻(xiàn)了魚腥味、青草味、脂肪味、油膩味、土腥味、蘑菇味等氣味特征,是烏鱧腥臭味的主要來源。

        3 討論

        水產(chǎn)動(dòng)物中腥味物質(zhì)的組成較為復(fù)雜,同一種原料不同部位的腥味組成會(huì)存在差異。本研究表明,烏鱧魚皮中腥味物質(zhì)最多,而肌肉中相對(duì)較少,主要與魚類自身結(jié)構(gòu)及生活環(huán)境有關(guān),這與王國超等[33]報(bào)道的結(jié)果相一致。脂肪含量較高的魚體中往往含有更多的腥味物質(zhì),這是由于脂肪分解后易產(chǎn)生酮、醛類等揮發(fā)性物質(zhì)。而脂肪分解所需的酶類及微生物更多地存在于魚皮及內(nèi)臟中。淡水魚中含有較強(qiáng)的土臭味與泥土味,此外,水體中的某些藻類及放線菌又會(huì)加重魚體中的腥味。而這些腥味物質(zhì)往往是先進(jìn)入魚體內(nèi)臟,再進(jìn)入肌肉組織中。

        目前,水產(chǎn)動(dòng)物中腥味物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法主要包括感官評(píng)價(jià)及儀器檢測(cè)分析。感官評(píng)定是最方便、最直接的方法,但一般需要專業(yè)的感官評(píng)定者完成,其結(jié)果存在一定的主觀性。儀器檢測(cè)分析方法則是利用前處理技術(shù)與色譜質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中揮發(fā)性成分的分析,其中HS-SPME-GC/MS 技術(shù)是最為常用的儀器分析方法。作者前期利用傳統(tǒng)的HS-SPMEGC/MS 測(cè)定了5 種不同提取方法制備的甲魚油中的揮發(fā)性成分,結(jié)果表明,需在60 ℃條件下吸附30 min,前處理時(shí)間較長(zhǎng)[17]。而本試驗(yàn)采用激光照射促釋技術(shù)僅需5 min,且離子強(qiáng)度相差不大,證明新型激光促釋技術(shù)結(jié)合固相微萃取能快速有效地測(cè)定烏鱧不同部位的揮發(fā)性成分。后續(xù)研究可嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于更多不同的樣品中。

        4 結(jié)論

        烏鱧4 個(gè)部位的揮發(fā)性成分種類和含量都有明顯不同,尤其是呈現(xiàn)魚腥味、土腥味的壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇在4 個(gè)部位的含量差異較大。PCA 發(fā)現(xiàn),4 個(gè)部位能明顯區(qū)分開,且模型中的數(shù)據(jù)有效可靠,沒有異常值,并證明了4 種樣品間有明顯差異;OPLS-DA 確定了壬醛、己醛、1-辛烯-3-醇為判別4 個(gè)部位最主要的氣味物質(zhì),貢獻(xiàn)了魚腥味、青草味、脂肪味、油膩味、土腥味、蘑菇味等,是烏鱧特征氣味的主要來源。

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