余楊健 謝和兵 ， 尼瑪次仁 ， 白瑪?shù)┰?，

（1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230013；2南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司，江蘇 南通 226133；4西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，西藏 日喀則 857000）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）屬菊科一年生草本植物，多分布于新疆、云南、西藏、四川等地，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛的功效［1］。紅花作為中藥制劑中出現(xiàn)頻率較高的單味藥，是桃紅四物湯、二十五味珍珠丸等中成藥的重要原料藥之一［2-3］。紅花被衛(wèi)生部列為藥食同源類花類品種，還兼作染料、飼料等的原料［4］。紅花中含有豐富的黃酮類［5］、生物堿［6］、苷類［7］、甾醇［8］、多糖［9］等成分，現(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)紅花中的黃酮類成分研究最多。黃酮類成分主要包括羥基紅花黃色素A、槲皮素、蘆丁和山柰酚等，《中華人民共和國藥典》（2020 版）中同時(shí)將羥基紅花黃色素A 和山柰酚列為紅花藥材的含量質(zhì)檢指標(biāo)［10］。其中羥基紅花黃色素A是紅花的水溶性有效成分，屬于單查爾酮苷類化合物［11］，具有抗心肌缺血損傷［12-14］、抗炎［15-16］、抗帕金森?。?7-18］、抗血栓［19］、降血糖［20］等多重藥理作用。

紅花藥材在種植、貯藏、加工炮制過程中常會(huì)引入微生物，而微生物超標(biāo)會(huì)影響藥材和成品的質(zhì)量，因此，在制劑的生產(chǎn)過程中常需對(duì)原料藥材、中藥提取物或制劑成品進(jìn)行滅菌處理。目前常用的中藥滅菌方法包括干熱滅菌、微波滅菌、過熱蒸汽滅菌、輻照滅菌等［21］。紅花中的有效成分羥基紅花黃色素A對(duì)光、熱敏感［22-23］，易受外界條件的影響而發(fā)生改變［24-25］，常規(guī)的濕熱、干熱等滅菌工藝均會(huì)對(duì)紅花的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。而輻照滅菌技術(shù)是利用電離輻射產(chǎn)生的電磁波直接作用于物體分子結(jié)構(gòu)來殺滅微生物的一種方法，屬于“冷滅菌”工藝。與其他滅菌方法相比，輻照滅菌反應(yīng)溫和、滅菌迅速、不會(huì)破壞藥物的有效成分，且不會(huì)殘留有害物質(zhì)［26］，適用于含熱敏性成分中藥材的滅菌處理［27-28］，目前已廣泛應(yīng)用于中藥材、藥品、食品、醫(yī)療器械等滅菌領(lǐng)域。2020 版《中華人民共和國藥典》中的“輻射滅菌法”規(guī)定“能夠耐輻射的醫(yī)療器械、生產(chǎn)輔助用品、藥品包裝材料、原料藥及成品等均可用本法滅菌”［29］。輻照滅菌技術(shù)包括60Co 輻照滅菌和電子加速器輻照滅菌。電子加速器輻照滅菌技術(shù)被譽(yù)為“21 世紀(jì)綠色滅菌加工技術(shù)”，可以通過發(fā)射高能電子束對(duì)藥物進(jìn)行滅菌，與60Co輻照滅菌相比更安全環(huán)保、能耗更低，能量利用率高且不產(chǎn)生核廢物［30-32］。

本研究通過不同強(qiáng)度的電子束輻照處理紅花藥材，比較輻照前后紅花粉末和紅花水提液性狀、顯微、薄層、微生物及羥基紅花黃色素A含量變化，旨在為紅花和含紅花制劑的輻照滅菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花購于西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司鑒定為菊科植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥花；羥基紅花黃色素A 對(duì)照品（純度為96.8%）、紅花對(duì)照藥材，中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；磷酸（優(yōu)級(jí)純），甲酸、丙三醇、乙酸、乙酸乙酯、丙酮為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

20B高效萬能粉碎機(jī)，常州市強(qiáng)迪干燥設(shè)備有限公司；WMS-1037生物光學(xué)顯微鏡，上海無陌光學(xué)儀器有限公司；SHZ-A 雙數(shù)顯水浴恒溫振蕩器、UC-250DE 超聲清洗儀，上海精其儀器有限公司；Essentia LC-16 高效液相色譜儀，日本島津公司；DZ-10/20 電子加速器，安徽戈瑞電子科技股份有限公司；XSR205DU/AC 十萬分之一天平，美國梅特勒托利多科技有限公司；數(shù)顯電熱套，杭州振和科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理及輻照劑量的選擇 用20B 高效萬能粉碎機(jī)將紅花藥材粉碎成粗粉，過3 號(hào)篩（50 目）。將紅花粉末分為6組，裝入透明PET瓶中，每組4瓶，每瓶15 g，即得紅花粉末組。取紅花粉末30 g 置于圓底燒瓶中加12 倍水回流提取3 次，每次0.5 h，合并水提液。將紅花水提液分為6 組，裝入透明PET 瓶中，每組3 瓶，每瓶40 mL，即得紅花水提液組。所有試驗(yàn)用輻照樣品均由中廣核戈瑞科技有限公司采用電子加速器進(jìn)行輻照滅菌處理，輻照劑量分別為0、4、6、8、10 kGy。

1.3.2 性狀觀察 通過日光下目視、手觸、鼻嗅、口嘗等方式對(duì)紅花粉末和紅花水提液外觀、色澤、氣味、味道等進(jìn)行直觀判斷［33］。

1.3.3 顯微鑒別 參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則2001 顯微鑒別法［29］，取紅花粉末過5 號(hào)篩（80 目），挑取少量置于載玻片上，滴加甘油醋酸試液，蓋上蓋玻片，置于WMS-1037生物光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4 薄層色譜定性鑒別 分別取徑0、4、6、8、10 kGy 劑量輻照滅菌處理的紅花粉末各0.5 g 于具塞錐形瓶中，加80%丙酮5 mL，密塞，置于SHZ-A雙數(shù)顯水浴恒溫振蕩器中振搖15 min，靜置，用玻璃漏斗過濾，取濾液作為紅花供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同法制成紅花對(duì)照品溶液。參照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502 薄層色譜法［29］，吸取紅花對(duì)照品溶液和上述各供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。

1.3.5 羥基紅花黃色素A含量測定

1.3.5.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18 液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：403 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

1.3.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品13.23 mg于100 mL容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液，濃度為0.13 mg·mL-1。

1.3.5.3 紅花粉末供試品溶液的制備 取紅花粉末約0.4 g 置于具塞錐形瓶中，加入25%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得紅花粉末供試品溶液。

1.3.5.4 紅花水提液供試品溶液的制備 取紅花水提液5 mL 置于10 mL 容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得紅花水提液供試品。

1.3.5.5 羥基紅花黃色素A 含量測定 吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按1.3.5.1色譜條件用Essentia LC-16 高效液相色譜儀測定，記錄目標(biāo)峰峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算紅花粉末和紅花水提液中羥基紅花黃色素A含量。計(jì)算公式如下：

紅花粉末中羥基紅花黃色素A含量=（供試品溶液峰面積×對(duì)照品溶液濃度）/（對(duì)照品溶液峰面積×供試品溶液濃度）×100%；

紅花水提液中羥基紅花黃色素A含量=（供試品溶液峰面積×對(duì)照品溶液濃度×供試品溶液稀釋倍數(shù)×紅花水提液總體積）/（對(duì)照品溶液峰面積×紅花質(zhì)量）×100%。

1.3.6 微生物限度測定 參照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則1105 微生物計(jì)數(shù)法、1106 控制菌檢查法和1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)［29］，對(duì)輻照前后紅花粉末和紅花水提液細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及大腸菌群進(jìn)行檢查。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，輻照前后含量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析中的事后多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照前后性狀觀察

由圖1 可知，輻照前后紅花粉末和紅花水提液外觀、色澤、氣味均未發(fā)生明顯變化。紅花粉末呈紅黃色或紅色，質(zhì)柔軟，氣微香，味微苦；紅花水提液呈棕褐色，氣微香，味苦澀。說明電子加速器輻照滅菌對(duì)紅花粉末和紅花水提液性狀無明顯影響。

圖1 輻照前后紅花粉末和紅花水提液性狀Fig.1 Characteristics of safflower powder and safflower aqueous extract before and after irradiation

2.2 輻照前后紅花粉末的顯微鑒別

由圖2可知，紅花粉末輻照前在顯微鏡下可見花冠、花絲、柱頭碎片分布，有長管狀分泌細(xì)胞位于導(dǎo)管旁，含黃棕色至紅棕色分泌物。花冠裂片頂端表皮細(xì)胞外壁突起呈短絨毛狀。柱頭和花柱上部表皮細(xì)胞分化成圓錐形單細(xì)胞毛，先端尖或稍鈍?；ǚ哿ｎ悎A形、橢圓形或橄欖形，具3個(gè)萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起。草酸鈣方晶常見于薄壁細(xì)胞中。輻照后上述顯微特征均能看到，說明電子加速器輻照滅菌未明顯改變紅花粉末顯微特征。

圖2 紅花粉末輻照前后顯微特征（10×40）Fig.2 Microscopic characteristics of safflower powder before and after irradiation （10×40）

2.3 輻照前后紅花粉末薄層鑒別

在供試品色譜中，經(jīng)0、4、6、8、10 kGy 輻照劑量輻照的紅花粉末在與紅花對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，說明電子加速器輻照滅菌未明顯改變紅花粉末薄層色譜（圖3）。

圖3 紅花粉末輻照前后薄層色譜圖Fig.3 Thin layer chromatogram of safflower powder before and after irradiation

2.4 輻照前后紅花粉末和紅花水提液中羥基紅花黃色素A含量變化

不同劑量輻照下紅花粉末和紅花水提液中羥基紅花黃色素A 含量測定高效液相色譜圖見圖4 和圖5。結(jié)果表明，輻照前后目標(biāo)峰圖譜無明顯改變。輻照前后紅花粉末及其水提液中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果如表1 所示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，輻照前后紅花粉末羥基紅花黃色素A含量無顯著變化；與輻照前相比，輻照后紅花水提液羥基紅花黃色素A 含量明顯下降，其中6、8、10 kGy組均具有顯著性差異。

表1 不同輻照劑量對(duì)紅花中羥基紅花黃色素A含量的影響（n=2）Table 1 Content of hydroxysafflor yellow A before and after irradiation of safflower powder and safflower aqueous extract （n=2）

圖4 不同輻照劑量下紅花粉末高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography of safflower powder under different irradiation doses

圖5 不同輻照劑量下紅花水提液高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography of safflower aqueous extract under different irradiation doses

2.5 微生物限度變化

輻照前紅花粉末和紅花水提液微生物限度均不符合《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則中非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（細(xì)菌總數(shù)≤2×103CFU·g-1，霉菌和酵母菌總數(shù)≤200 CFU·g-1，控制菌大腸埃希菌不得檢出）［29］。輻照后細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均顯著下降（P＜0.05），分別采用6 kGy和4 kGy輻照劑量輻照時(shí)，紅花粉末和紅花水提液霉菌和酵母菌總數(shù)及大腸菌群總數(shù)達(dá)到藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)菌總數(shù)仍很高，當(dāng)輻照劑量為10 kGy 時(shí)，紅花粉末和水提液細(xì)菌總數(shù)達(dá)到藥典規(guī)定水平（表2）。

表2 不同輻照劑量對(duì)紅花微生物限度的影響（n=2）Table 2 Effect of different irradiation doses on microbial limit of safflower（n=2）

3 討論

3.1 電子加速器輻照對(duì)紅花及其水提液定性指標(biāo)的影響

中藥材的質(zhì)量變化情況通常從性狀顯微、薄層鑒別三個(gè)方面進(jìn)行初步定性判斷。性狀是考察藥材質(zhì)量變化最直觀的指標(biāo)，顯微鑒別可以確定藥材固有的組織、細(xì)胞、內(nèi)含物特征，薄層鑒別可以對(duì)藥材的主要化學(xué)成分進(jìn)行定性比對(duì)。但中藥材的成分復(fù)雜，尤其是含有淀粉、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的中藥材性狀、顯微等定性指標(biāo)易在加工炮制、熱滅菌等過程中發(fā)生顯著變化。輻照滅菌技術(shù)最大的優(yōu)勢在于滅菌過程中不改變藥材的溫度，屬于一種冷滅菌技術(shù)，對(duì)藥材的性狀等定性指標(biāo)影響較小。本研究表明，電子加速器輻照后，紅花及其水提液性狀、顯微、薄層鑒別均無明顯改變，符合電子束輻照作用溫和、無殘留的特點(diǎn)。

3.2 電子加速器輻照對(duì)紅花及其水提液有效成分含量變化的影響

紅花及其相關(guān)制劑的滅菌方式一般采用濕熱滅菌，但紅花中的羥基紅花黃色素A 在受熱和堿性條件下極不穩(wěn)定，會(huì)降解成對(duì)羥基苯甲醛和對(duì)羥基肉桂酸［34］。羥基紅花黃色素A 的不穩(wěn)定性可能與其分子結(jié)構(gòu)中所含的官能團(tuán)有關(guān)，羥基、羧基等基團(tuán)的存在導(dǎo)致黃酮類的B 環(huán)與A 環(huán)脫離，從而降低了羥基紅花黃色素A 的穩(wěn)定性［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)電子束輻照后，紅花粉末中羥基紅花黃色素A 含量未發(fā)生顯著變化，而紅花水提液中有效成分羥基紅花黃色素A含量整體顯著下降，其原因可能是在水溶液狀態(tài)下，電子束穿透性更高，高能電子束直接作用于細(xì)菌的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)達(dá)到殺菌的同時(shí)，使水發(fā)生電離產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的氧離子［36］，增加了羥基紅花黃色素A 分子的不穩(wěn)定性；而在干燥粉末狀態(tài)下，含水量較低，電子束穿透性降低，高能電子束殺菌的同時(shí)產(chǎn)生的氧離子較少，對(duì)羥基紅花黃色素A 分子的穩(wěn)定性影響較小。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)紅花醇提液經(jīng)60Co 輻照滅菌后，羥基紅花黃色素A 含量發(fā)生了顯著變化［37］，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。由此推斷，含紅花的水或乙醇提取物及以羥基紅花黃色素A為活性成分的水溶液或乙醇溶液制劑均不宜采用電子束、60Co輻照的方法進(jìn)行滅菌。

3.3 電子加速器輻照對(duì)紅花及其水提液微生物的影響

紅花在田間種植、人工采摘、自然晾干、儲(chǔ)存等過程中容易被微生物污染，1997年衛(wèi)生部發(fā)布的《60Co輻射中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》中將紅花列為允許輻照的中藥材品種之一［38］。輻照技術(shù)可以通過發(fā)射高能射線直接或間接作用于微生物的生物大分子，如核糖核酸、酶、蛋白質(zhì)等，破壞其結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑制或殺死微生物的效果，具有廣譜性，但不同微生物對(duì)電離輻射的敏感性不同。本研究表明，與輻照前相比，4～10 kGy 輻照處理均能顯著降低細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，且輻照劑量與細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說明紅花及水提液中的微生物對(duì)電子束的敏感性較高。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，含紅花的水提物以及以羥基紅花黃色素A為活性成分的水溶液制劑不宜采用電子束輻照進(jìn)行滅菌，而紅花粉末以及以羥基紅花黃色素A為活性成分的固體制劑可用電子束輻照進(jìn)行滅菌，為紅花和含紅花制劑的輻照滅菌提供了參考依據(jù)。