姚一凡 張伊陽 董仕慧 李 睿 張 蘭 周熳琳喬自林 楊 琨 ,
(1西北民族大學生物醫(yī)學研究中心,甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心,甘肅 蘭州 730030;2西北民族大學生物醫(yī)學研究中心,生物工程與技術國家民委重點實驗室,甘肅 蘭州 730030;3西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730030)
氧氣是動物生長發(fā)育必需的條件之一,而低氧是高原動物生存所面臨的最大挑戰(zhàn)之一[1]。前人研究發(fā)現(xiàn),低氧分壓會導致機體組織中的氧氣供應不足,從而影響動物正常的生理功能[2]。與平原地區(qū)動物相比,生活在高原極端環(huán)境下的動物對低氧環(huán)境具有獨特的適應機制[1]。牦牛作為青藏高原上的特有物種,是研究低氧環(huán)境適應良好的模式動物,具有重要的研究價值[3]。黑白花牛是中國黃牛和荷蘭荷斯坦牛的雜交品種,長期生活在平原地區(qū),與牦牛的生活環(huán)境有較大的海拔差異,因此可作為牦牛的對照模型加以研究。
低氧條件下,動物機體可以通過改變體內(nèi)某些物質(zhì)代謝活性,增強氧氣攝入和轉(zhuǎn)運能力,維持組織間氧氣水平,促進其生長、發(fā)育和繁殖,同時降低缺氧對機體的損害[3]。此外,高原動物還可通過調(diào)控線粒體氧化代謝相關的信號通路,使機體在組織與細胞層面發(fā)生一系列的生理生化反應,確保動物能在缺氧的環(huán)境中正常生活[4]。腎臟作為動物循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分,在高原動物適應缺氧環(huán)境過程中發(fā)揮重要功能[5]。有研究表明,環(huán)境缺氧和不同疾病引起的腎臟局部缺氧可能導致腎功能嚴重受損,引起慢性腎炎、慢性間質(zhì)性腎炎、腎病綜合征、無癥狀性蛋白尿等慢性疾?。?-7]。腎臟在這些疾病的發(fā)生過程中,均存在著不同程度因缺氧而產(chǎn)生的腎間質(zhì)細胞纖維化,因此,腎間質(zhì)成纖維細胞(renal interstitial fibroblasts,RIFs)在低氧所致各類腎源性疾病的腎間質(zhì)纖維化過程中起決定性作用[8]。
丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)是調(diào)節(jié)線粒體丙酮酸脫氫酶復合物(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)活性的四種PDK 同工酶(PDK1、PDK2、PDK3、PDK4)之一[9]。在糖代謝過程中,PDK1 通過作用于丙酮酸脫氫酶,將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A,1ACOH)并進入線粒體參加三羧酸循環(huán)[10]。在低氧條件下,低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)對PDK1有顯著的調(diào)控作用,使其在機體內(nèi)的表達隨氧濃度的變化改變,并通過不同途徑如PDK1/AKT 通路、TGF-β/Smad2 通路等參與到細胞生長代謝過程,進一步調(diào)節(jié)Bcl-2、Caspase3/9 等下游凋亡因子誘導細胞凋亡、自噬[11-12]。
目前低氧慢性病相關研究所采用的動物模型主要集中于小鼠和大鼠[13-15],針對高原動物本身的研究還存在部分空白。為進一步探索高原動物的低氧適應機制,本研究通過觀察低氧對PDK1及其下游因子TGF-β/Smad2、Caspase3/9等在牦牛和黑白花牛RIFs中的表達差異,分析不同海拔牛種RIFs 低氧的應激差異,探究牦牛腎臟低氧適應機制,旨在為治療低氧導致的慢性腎病提供治療思路,為高原醫(yī)療提供參考資料。
1.1.1 試驗動物 牦牛腎組織樣本分離自甘南藏族自治州,黑白花牛腎組織樣本采集自西安市某屠宰場。
1.1.2 主要設備及試劑 CCL-170B-8 三氣箱,購自新加坡藝思高科技有限公司;CX31 光學顯微鏡、IX73倒置熒光顯微鏡,購自奧林巴斯(中國)有限公司;IE1000 細胞計數(shù)儀,購自上海睿鈺生物科技有限公司;Multiskan SkyHigh 酶標儀,購自美國賽默飛世爾科技公司;CFX96 實時熒光定量PCR 儀,購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。新生牛血清(newborn bovine serum,NBS),購自蘭州民海生物工程有限公司;高糖(DMEM/HIGH GLUCOSE)培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS),購自北京賽澳美技術有限公司;PDK1、Smad2、Caspase3、Cytokeratin-18 和Vimentin 抗體,購自北京博奧森生物技術有限公司;熒光二抗、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI),購自上海碧云天生物技術有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒采購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;4×蛋白上樣緩沖液、增強型化學發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence,ECL)、細胞培養(yǎng)用青鏈霉素混合液(100×),購自北京索萊寶科技有限公司。
1.2.1 牦牛、黑白花牛腎原代細胞分離、培養(yǎng) 將青鏈霉素混合液100倍稀釋后按1∶10比例加入生理鹽水內(nèi)得到10%雙抗生理鹽水,分別取兩種牛完整腎臟浸泡于上述試劑中,由屠宰場運輸至實驗室,噴灑75%酒精消毒后移入超凈臺。剖開腎臟腎間質(zhì)組織,用含有10%雙抗的PBS 清洗后用眼科剪剪成約1 mm3小塊。每瓶12 塊組織均勻鋪于T25 細胞瓶底部,將細胞瓶背面朝上并在每瓶中加入2 mL 含有10%NBS 的DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置12 h,待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)細胞瓶使組織塊浸入培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。細胞從組織塊分裂出并貼壁融合率達到約90%后,用PBS洗去組織塊后按照1∶4比例傳代或凍存。
1.2.2 牦牛、黑白花牛RIFs 純化 依據(jù)成纖維細胞貼壁較快的特點,利用差速貼壁法純化細胞。將細胞用0.25%胰酶消化制成懸液后按1∶4的比例傳代至新T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3~4 h,觀察細胞貼壁情況。細胞貼壁率約70%時換液,除去未貼壁細胞后得到純度較高的成纖維細胞。繼續(xù)培養(yǎng),待細胞生長至80%左右后傳代或凍存。
1.2.3 牦牛、黑白花牛RIFs 鑒定 在六孔板中鋪設細胞爬片,將傳代至第五代的細胞按每孔5×105個接種于六孔板中培養(yǎng)24 h,待細胞貼爬片生長至約80%后用PBS漂洗;在固定液中固定15 min后再次漂洗,用0.5%曲拉通X-100處理20 min增加細胞膜通透性;漂洗后滴加正常山羊血清封閉液,室溫封閉1 h;吸干封閉液后分別滴加一抗角蛋白-18(Cytokeratin-18,CK18)和波形蛋白(Vimentin),37 ℃條件下孵育2 h;PBS漂洗后滴加熒光二抗山羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h;PBS 漂洗后滴加DAPI 染液處理細胞核5 min;清洗并封片后觀察并拍攝熒光照片。
1.2.4 牦牛、黑白花牛RIFs生長曲線測繪 自第0天起將黑白花牛、牦牛腎間質(zhì)成纖維細胞第五代分別以每孔5×103個的數(shù)量各接種于24 孔板內(nèi),每種細胞設置24 個復孔并分為低氧培養(yǎng)(氧濃度1%)和常氧培養(yǎng)(氧濃度21%)兩組,每24 h 每組細胞消化3 孔計數(shù)至細胞生長進入平臺期,繪制增殖曲線并計算倍增時間,計算公式為:
式中,X為細胞接種密度,Y為細胞生長峰值前一天的細胞密度,T為計數(shù)時間點。
1.2.5HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2、Caspase3、Caspase9基因表達水平檢測 取低氧(1%)和常氧(21%)組細胞,用Trizol 法提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR),引物序列見表1。反應體系共20 μL:2× Universal SYBR Green Fast qPCR MIX 10 μL、cDNA 模板0.2 μL、正向引物和反向引物各0.4 μL,ddH2O 9 μL。反應條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性5 s,60 ℃退火32 s,45 個循環(huán)。每個基因設置3 個復孔。用2-△△CT法計算基因的mRNA相對表達量。
表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information of qRT-PCR
1.2.6 PDK1、Smad2、Caspase3 蛋白表達水平檢測 取低氧和常氧組細胞在冰上用放射免疫沉淀試驗(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液進行蛋白裂解,將提取的蛋白定量后按照3∶1 的比例加入4×loading buffer,恒溫金屬浴100 ℃中10 min 至變性。取10 μL 蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide glue,SDSPAGE),用濕轉(zhuǎn)法將其蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,5%脫脂奶粉配置封閉液并室溫封閉2 h,HIF-1α(1∶1 000)、Smad2(1:250)、Caspase3(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)稀釋于脫脂奶粉、4 ℃條件下孵育過夜。二抗(1∶1 000)稀釋于脫脂奶粉室溫孵育1 h,滴加ECL(enhanced chemi-luminescene)化學發(fā)光液用于顯影。每組重復測定3 次,Image J 1.0 軟件對條帶進行灰度值測量并以內(nèi)參蛋白為參照進行相對定量。
1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0軟件的ANOVA分析法對不同組別的基因和蛋白表達差異進行統(tǒng)計學分析,并使用Graphpad8.0軟件繪制圖表。
植塊法處理牦牛和黑白花牛腎組織后第4 天,可見細胞從組織中分裂出并貼壁(圖1-A、B),黑白花牛、牦牛腎原代細胞在光學顯微鏡下形態(tài)學觀察可見原代細胞呈不規(guī)則多邊形或梭形,完全融合后部分呈漩渦狀,部分呈鋪路石狀。經(jīng)差速貼壁法純化后得到純度較高的梭形,漩渦狀生長的成纖維細胞(圖1-C、D)。
圖1 牦牛、黑白花牛RIFs分離、純化與培養(yǎng)(40×)Fig.1 Isolation,purification and culture of RIFS from yak and Holstein (40 ×)
上皮類細胞特異性蛋白標志物CK-18 在純化后的牦牛和黑白花牛細胞表達均為陰性(圖2-A、B),波形蛋白(vimentin)為成纖維細胞特異性標志物,在兩種細胞內(nèi)均呈陽性表達且熒光信號較強(圖2-C、D)。試驗結(jié)果表明,培養(yǎng)的細胞為牦牛和黑白花牛腎間質(zhì)成纖維細胞且純度較高,可用于后續(xù)試驗。
圖2 牦牛、黑白花牛RIFs免疫熒光染色鑒定Fig.2 Identification of RIFS in yak and Holstein by immunofluorescence staining
細胞生長曲線測定結(jié)果顯示,牦牛腎間質(zhì)成纖維細胞在第5~第6天進入對數(shù)生長期,第6天之后進入平臺期,潛伏期(第1~第4天)低氧與常氧細胞增殖速度無明顯差異,對數(shù)生長期常氧組增殖能力較強(圖3-A)。低氧和常氧培養(yǎng)的黑白花牛RIFs均在第5天進入對數(shù)生長期,第6天進入平臺期,潛伏期(第1~第4 天)兩組細胞增殖速度無明顯差異,對數(shù)生長期過程中常氧組細胞生長速度明顯高于低氧組(圖3-B)。根據(jù)細胞生長曲線測得細胞生長峰值數(shù)量代入1.2.4 中公式計算得到:潛伏期內(nèi)牦牛細胞低氧組倍增所需時間約為48 h,黑白花牛細胞低氧組倍增時間約為44 h,牦牛RIFs在低氧條件下生長速度明顯低于黑白花牛。
圖3 黑白花牛、牦牛低氧和常氧組生長曲線Fig.3 Growth curves of Holstein and yak in hypoxia and normoxia groups
細胞生長曲線測得牦牛和黑白花牛RIFs 倍增時間約為44~48 h,故選擇細胞分裂周期48 h、中點24 h以及第二個分裂周期中點72 h,這3 個時間點制備基因和蛋白樣品。qRT-PCR 結(jié)果表明,兩種牛RIFs 的HIF-1α、PDK1、Smad2基因在低氧培養(yǎng)條件下對比常氧組均存在顯著或極顯著上調(diào)(圖4-A~C)。其中黑白花牛PDK1基因隨低氧培養(yǎng)時間增加而上調(diào),24 h時與0 h 相比無顯著差異,48 h 時差異顯著(P<0.05),培養(yǎng)72 h 時差異極顯著(P<0.001);而牦牛RIFs 中的PDK1則在24~72 h 時均極顯著上調(diào)(P<0.001),在24 h 時達到峰值(圖4-B)。黑白花牛的HIF-1α和Smad2在低氧培養(yǎng)至72 h 時極顯著上調(diào),而牦牛則在24 h 達到峰值,隨后下調(diào)至與對照無顯著差異。AKT1基因在黑白花牛RIFs 低氧培養(yǎng)至48 h 時表達量有顯著下調(diào),在牦牛中則在低氧培養(yǎng)24 h 時顯著上調(diào)(圖4-D)。此外,凋亡因子Caspase3在黑白花牛和牦牛RIFs 的不同低氧培養(yǎng)時間均有極顯著上調(diào),其中黑白花牛為72 h,牦牛為24 h(圖4-E)。另一種凋亡因子Caspase9在低氧培養(yǎng)至48 和72 h 時均極顯著上調(diào),但不同的是48 h時牦牛的上調(diào)倍數(shù)比黑白花牛更高(圖4-F)。綜上,牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3、AKT1基因整體上于24 h顯著上調(diào),之后下調(diào),而黑白花?;騽t整體上隨時間呈遞增趨勢。
圖4 PDK1相關基因表達檢測Fig.4 Expression detection of PDK1 related genes
蛋白免疫印跡結(jié)果顯示在低氧誘導條件下,黑白花牛和牦牛RIFs 中PDK1 蛋白表達量均極顯著上調(diào),其中黑白花牛PDK1 蛋白表達量上調(diào)倍數(shù)隨培養(yǎng)時間延長而增加,牦牛的PDK1 蛋白前48 h 也隨培養(yǎng)時間延長而增加,但在72 h 時比48 h 有所下降(圖5-B)。黑白花牛RIFs 的Smad2 蛋白僅在被低氧培養(yǎng)至72 h時顯著上調(diào),牦牛中則在整個低氧培養(yǎng)過程中(24~72 h)均有顯著上調(diào)(P<0.01)(圖5-C)。兩種牛RIFs內(nèi)的Caspase3 蛋白均上調(diào),但黑白花牛的Caspase3 上調(diào)倍數(shù)高于牦牛(圖5-D)。
圖5 PDK1相關蛋白表達檢測Fig.5 Detection of PDK1 related protein expression
成纖維細胞的分離培養(yǎng)常用方法包括植塊法、胰酶消化法、流式細胞分選法以及免疫磁珠法等[16-17]。本試驗選用了對細胞損傷最小的植塊法[18]對細胞進行分離,所得原代細胞中成纖維細胞比例約占總數(shù)的80%,雜細胞約占總量20%。為獲得更純凈的成纖維細胞,利用成纖維細胞貼壁較快的特性[19],通過差速貼壁的方式,待細胞貼壁率約70%時舍棄剩余的大部分雜細胞和小部分成纖維細胞獲得純度較高的成纖維細胞。細胞免疫熒光染色鑒定所得結(jié)果證明本研究選用的原代細胞分離與純化方法體系可行。本研究選用高糖型DMEM 培養(yǎng)基添加10%新生牛血清進行培養(yǎng)。經(jīng)驗證,差速貼壁法純化后的RIFs在10代之前的細胞凍存復蘇后仍能保持較好的增殖能力,可用于功能驗證。
在低氧對糖尿病小鼠模型的研究中,Zheng 等[20]發(fā)現(xiàn)低氧會增加糖尿病動物的循環(huán)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量;HIF-1α 在糖尿病動物腎臟及其他缺氧細胞中表達受到抑制。此時,受抑制的HIF-1α 通過下調(diào)PDK1 間接調(diào)控線粒體呼吸反應,導致線粒體ROS 減少,對糖尿病動物起到腎臟保護和抗細胞凋亡作用[21]。這說明HIF-1α 可通過調(diào)控PDK1活性,參與細胞增殖和凋亡過程[1,22]。已有證據(jù)表明PDK1、Smad2和Casp3在小鼠和人的信號通路中有直接調(diào)控關系并在表型驗證中起主要作用[23-24],且本研究結(jié)果中相應基因在牦牛RIFs 和黑白花牛RIFs 間表達差異具有顯著性,故本試驗選擇PDK1、Smad2和Casp3作為主要蛋白靶點進行下一步驗證,發(fā)現(xiàn)低氧誘導下牦牛PDK1 的基因和蛋白表達均有顯著上調(diào),且上調(diào)程度均大于黑白花牛;基因?qū)用?,牦牛RIFs 低氧處理24 h 時達到峰值,隨后顯著下調(diào),而黑白花牛則隨時間呈遞增趨勢。不僅證實了低氧對HIF-1α 和PDK1 的上調(diào)作用,也證明兩種牛對低氧環(huán)境的適應性存在差異。
已有研究表明,PDK1通過調(diào)控TGF-β可誘導成纖維細胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞[25]。此外,在低氧細胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),低氧通過誘導線粒體中蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的積累和磷酸化,激活AKTPDK1信號,促進PDK1的磷酸化,并上調(diào)Smad表達,從而促進TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導,影響TGF-β的表達[14]。同時,PDK1 與TGF-β 之間存在中間信號分子絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關蛋白(serine-threonine kinase receptor-associated protein,STRAP),可與PDK1 形成體內(nèi)復合物,進而穩(wěn)定TGF-β/Smad 信號[26]。TGF-β 調(diào)控Bcl-2 的表達,抑制細胞凋亡,繼而使細胞進一步活化、增殖與遷移,活化的細胞產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)[27]。本研究通過檢測黑白花牛和牦牛RIFs內(nèi)Smad2和AKT1基因表達發(fā)現(xiàn),這兩種基因在低氧培養(yǎng)的細胞內(nèi)均呈上調(diào)趨勢,與前期研究一致[26],牦牛RIFs 于24 h 達到峰值后下調(diào),黑白花牛RIFs 隨時間延長呈遞增趨勢,進一步證明低氧對牦牛的各因子的誘導作用與平原牛種存在種屬差異。此外,兩牛種細胞凋亡標志物Caspase3/9 因子的表達差異也符合以上理論,牦牛RIFs 于24~48 h 達到峰值后下調(diào),證明其在短期應激后適應了低氧環(huán)境,未出現(xiàn)明顯的凋亡趨勢,而黑白花牛RIFs 則隨低氧培養(yǎng)逐漸上調(diào),出現(xiàn)了明顯的凋亡趨勢。Zou等[28]通過藥物抑制大鼠TGF-β1通路,發(fā)現(xiàn)其腎纖維化程度因TGF-β1/Smad3通路的抑制而減輕。此外,前期研究表明,低氧引起的HIF-1α 轉(zhuǎn)錄復合物上調(diào)可誘導TGF-β 激活[29]。結(jié)合本研究中PDK1 和Smad2 在基因和蛋白水平上隨低氧而產(chǎn)生的調(diào)節(jié)預測,低氧誘導的PDK1/TGF-β/Smad2通路激活可能是促使黑白花牛腎纖維化程度加深,引發(fā)其腎源性高原疾病的主要原因之一。
Chen 等[23]發(fā)現(xiàn),沉默PDK1 和AKT 等因子會導致細胞的增殖能力降低,Shi 等[30]和Ikushima 等[31]也分別從不同層面證明了TGF-β/Smad 通路在成纖維細胞增殖中的調(diào)控作用呈正相關。低氧上調(diào)HIF-1α 和PDK1,進而上調(diào)下游因子TGF-β/Smad2和AKT1基因的表達量,從而促進了RIFs 增殖能力提高。牦牛在物種進化過程中已產(chǎn)生對低氧環(huán)境的適應性,故其腎臟在低氧下的纖維化程度較平原牛更輕[8],本研究中牦牛RIFs 增殖速度在低氧下比常氧低,可能是腎臟為適應低氧環(huán)境對纖維化加深產(chǎn)生抵抗所致。此外,低氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期后牦牛和黑白花牛RIFs的增殖能力遠低于常氧,推測其主要原因是1%濃度的極端低氧啟動了TGF-β下游的凋亡相關因子[24,28],導致Caspase3/9顯著上調(diào),打破了低氧下細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡,促進RIFs 細胞大量凋亡并引起增殖緩慢。同一因子在mRNA 和蛋白水平表達趨勢不一致可能是由于mRNA 與蛋白半衰期不同,低氧應激造成基因?qū)用嫠矔r變化且在指導蛋白質(zhì)合成過程中有其他轉(zhuǎn)錄因子的參與,從而影響蛋白的最終表達。牦牛和黑白花牛RIFs 的低氧下增殖能力的不同證實了兩物種對高原環(huán)境的適應性存在差異。但低氧通過以上因子在牛RIFs 內(nèi)對增殖能力和凋亡等表型的產(chǎn)生差異性作用的原因和具體調(diào)控機制仍需進一步研究。
低氧下黑白花牛和牦牛RIFs 中HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2和Caspase3/9基因和PDK1、Smad2、Caspase3蛋白表達相較于常氧組存在顯著上調(diào),且牦牛RIFs 于低氧24~48 h 達到峰值后下調(diào),黑白花牛則隨低氧培養(yǎng)時間增長而逐漸上調(diào),黑白花牛RIFs 低氧下增殖能力明顯高于牦牛,以上可能是引起低海拔動物低氧腎纖維化程度加重的原因之一,同時也證明了牦牛對低氧環(huán)境具有更好的適應性。