王 宇 趙 圓 王艷麗 俎天嬌 司增志 孫偉明 喬亞科 張 鍇

（河北科技師范學(xué)院，河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），河北 秦皇島 066004）

水通道蛋白（a quaporins，AQPs）是植物中運(yùn)輸水分及其他小分子物質(zhì)的重要通道，存在于所有真核生物和大多數(shù)原核生物中［1］。在高等植物中，AQPs 由6個高度保守的α-螺旋構(gòu)成跨膜結(jié)構(gòu)，通過A、B、C、D、E 5 個環(huán)相連接。水通道蛋白的B 環(huán)和E 環(huán)具有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）獨(dú)特結(jié)構(gòu)。B 環(huán)和E 環(huán)各自形成半個跨膜螺旋，圍繞形成狹窄的水孔，形成水通道蛋白的“水漏”結(jié)構(gòu)模型［2］。

根據(jù)AQPs 在細(xì)胞內(nèi)的位置可分為7 個亞族：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsicproteins，PIPs）、液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、類根瘤素26（NOD26）膜蛋白（nodulin-26 like intrinsic proteins，NIPs）、膜內(nèi)在小分子堿性蛋白（small basic intrinsic proteins，SIPs）、類GlpF 膜內(nèi)在蛋白（GlpF-like intrnsic proteins，GIPs）、混合內(nèi)在蛋白（hybrid intrinsic proteins，HIPs）和未鑒定的膜內(nèi)在蛋白（X intrinsic proteins，XIPs）［3］。PIPs 存在于細(xì)胞質(zhì)膜上，分為PIP1和PIP2 兩個亞類；TIPs 有α、β、γ、δ、和ε 五個亞類，分別存在于不同液泡膜上［4］；NIPs 位于質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)膜上，分為NOD26和LIP2兩個亞類；SIPs位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，分為SIP1 和SIP2 兩個亞類，可促進(jìn)水分運(yùn)輸［5］；GIPs和HIPs 僅存在于小立碗蘚（Physcomitrella patens）等幾種苔蘚植物中［6］。

目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中已發(fā)現(xiàn)35 個AQPs［7］、玉米（Zea mays）中36 個AQPs［8］、水稻（Oryza sativa）中33 個AQPs［9］、栽培大豆（Glycine max）中72個AQPs［10］、野生大豆（Glycine soja）中鑒定了62個AQPs［11］。前人研究結(jié)果說明水通道蛋白PIPs基因亞家族在植物對抗干旱、鹽脅迫等非生物脅迫時具有正向調(diào)控作用［11-16］。但是也有一些不同研究結(jié)果的報(bào)道，如Wang等［17-18］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)野生大豆GsPIP2；1和GsTIP2；1的轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性降低。此外，干旱脅迫下，不同植物中的PIPs基因表達(dá)量也不同［19-20］。以上研究結(jié)果表明，植物AQPs的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)調(diào)控比較復(fù)雜，AQPs在調(diào)控植株非生物脅迫中的功能尚需進(jìn)一步研究。

本課題組（河北科技師范學(xué)院野生大豆資源課題組）前期篩選到耐旱性強(qiáng)的野生大豆材料永46，對其干旱脅迫后的基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與敏感材料相比，高耐旱野生大豆材料在干旱脅迫后AQPs基因存在顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。為了進(jìn)一步明確AQPs 在野生大豆抗旱反應(yīng)中的分子功能，本研究對野生大豆中的AQPs 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究耐旱野生大豆材料的AQPs基因在干旱脅迫后的基因轉(zhuǎn)錄譜；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在擬南芥中過表達(dá)GsPIP2；7基因，分析基因過表達(dá)植株與野生型在干旱脅迫下的耐旱能力差異，以期明確野生大豆中AQPs基因在干旱脅迫中的表達(dá)情況，揭示GsPIP2；7在野生大豆耐干旱脅迫中的調(diào)控功能，為培育耐旱栽培大豆奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料種植及取樣方法

高耐旱野生大豆材料永46 由河北科技師范學(xué)院野生大豆資源課題組提供。由于野生大豆籽粒外覆泥漿膜，播種之前需用小刀切種，切種在野生大豆籽粒種臍背面進(jìn)行，避免破壞種臍。切種后的野生大豆籽粒播種于鋪滿營養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，上覆薄層蛭石。培養(yǎng)缽置于溫度25 ℃（白天）/15 ℃（晚上）、日照長度14 h的溫室中。野生大豆植株生長21 d 后，在營養(yǎng)缽中倒入300 mL 濃度為20%的PEG 6000 模擬干旱脅迫處理。干旱脅迫后分別在0（未干旱脅迫，對照）、6、12、24和48 h后隨機(jī)取野生大豆材料葉片1 g，迅速保存于液氮中，作為轉(zhuǎn)錄組分析的樣本。所有樣品設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測序數(shù)據(jù)來源

永46 在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄譜由華大基因（北京）進(jìn)行測序。提取野生大豆葉片RNA，構(gòu)建cDNA 文庫，利用BGISEQ-500 平臺進(jìn)行測序。利用Trimmomatic 0.36 軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，HISAT2 2.1.0 軟件比對野生大豆（Glycine soja）參考基因序列。通過華大基因交互系統(tǒng)（https：//report.bgi.com/ps/login/login.html）篩選在干旱脅迫后顯著變化（|log2FoldChange|＞1.5）的AQPs基因，基因表達(dá)量采用FPKM（Fregments Per Kilobase per Million）法進(jìn)行計(jì)算，利用Heml 1.0.3.7 軟件對取對數(shù)值（log2）的基因表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，利用MEME（http：//alternate.meme-suite.org/tools/meme）在線分析工具進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，利用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）在線分析工具進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.3 GsPIP2;7基因克隆及轉(zhuǎn)基因擬南芥后代鑒定

提取液氮保存的野生大豆材料永46的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，利用引物F（5′→3′）：GCTCTAGAA TGGCTAAAGATGTTGAGG/R（3′→5′）：AGGCCCGGGT TAAGCGTTGCTTCTGAAG 擴(kuò)增GsPIP2；7基因（glysoja_008314）。擴(kuò)增的基因連接到pMD18 載體（D101A，寶生物工程有限公司，大連）上，后轉(zhuǎn)到表達(dá)載體pCHAC（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供）上，以pCHAC：：GsPIP2；7陽性載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。擬南芥Columbia-0 生態(tài)型為受體，待植株生長至抽苔狀態(tài)，將擬南芥的花蕾部位置于含有農(nóng)桿菌滲透液中浸花5 min，將擬南芥植株在黑暗條件下培養(yǎng)24 h 后正常培養(yǎng)，獲得T0代轉(zhuǎn)基因材料。收獲T0代種子種植，對生長的T1代轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行潮霉素抗性篩選，即在含有20 mg·L-1潮霉素的MS 培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗性篩選。培養(yǎng)7 d后，待擬南芥2 片子葉展開，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無抗生素的MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲陽性后代轉(zhuǎn)基因材料。T2代轉(zhuǎn)基因材料篩選方法同T1代材料，最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因材料。

1.4 轉(zhuǎn)GsPIP2;7基因擬南芥基因表達(dá)分析

轉(zhuǎn)基因植株GsPIP2；7基因表達(dá)量的測定參照王宇等［21］的方法。T3代純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的種植及干旱處理方法同1.1。取轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥材料植株葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，以擬南芥的Actin基因作為內(nèi)參基因，所用引物如下：GsPIP2；7基因引物F（5′→3′）：GTCGTTGA TAAGGGCGTTGT/R（3′→5′）：GCACCCAAAGCAGTACCA TT；Actin基因引物F（5′→3′）：TGGAATCCACGAGACA ACCTA/R（3′→5′）：TTCTGTGAACGATTCCTGGA。采用One Step SYBR?PrimeScript? RT-PCR Kit 試劑盒（RR066A，寶生物工程有限公司，大連）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）反應(yīng)，利用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀（伯樂，美國）測定目的基因及內(nèi)參基因的Ct 值。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.5 轉(zhuǎn)GsPIP2;7基因擬南芥生長及生理指標(biāo)測定

干旱脅迫后7 d進(jìn)行干物質(zhì)重和葉面積測定；利用根系分析系統(tǒng)進(jìn)行植株根系測定；干旱脅迫后0 h（未干旱脅迫，對照）、12、24 和48 h 后取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥同一葉位的葉片測定如下生理指標(biāo)：利用氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光還原比色法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；利用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；利用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；利用80%丙酮比色法測定葉綠素含量；利用過氧化氫酶測定試劑盒（A007-1-1，南京建成生物工程研究所）測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各處理的差異顯著性分析，以P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生大豆AQPs基因表達(dá)及蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過野生大豆轉(zhuǎn)錄組分析的基因注釋結(jié)果，鑒定到野生大豆中的69個GsAQPs基因。對69個GsAQPs基因所屬亞族進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)15個屬于NIPs亞族，25個屬于PIPs 亞族，23 個屬于TIPs 亞族，6 個屬于XIPs 亞族。對69 個GsAQPs 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)全部GsAQPs蛋白均含有2 個NPA 基序結(jié)構(gòu)，同一亞族中的蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域，如所有的GsPIPs 均具有質(zhì)膜水孔蛋白的保守結(jié)構(gòu)域GGGANXXXXGY，但在其他亞族蛋白中均不含有此結(jié)構(gòu)域，說明GsAQP 蛋白具有一定的保守性，并且各個亞族保守性存在差異（電子附圖1）。

在干旱脅迫下，抗旱野生大豆材料中有10 個GsPIPs基因表達(dá)差異達(dá)到顯著水平（圖1）。10 個差異表達(dá)GsPIPs基因有兩種表達(dá)模式：處理后6 和24 h 顯著上調(diào)表達(dá)，GsPIP1；9、GsPIP1；12、GsPIP2；8、GsPIP2；7屬于此種表達(dá)模式；處理后先下調(diào)表達(dá)，至24 h后上調(diào)表達(dá)，GsPIP2；2、GsPIP2；3、GsPIP1；4基因?qū)儆诖朔N表達(dá)模式。對10 個差異表達(dá)GsPIPs基因的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2），發(fā)現(xiàn)除GsPIP2；7 外，其余9 個GsPIPs 蛋白均有6個跨膜結(jié)構(gòu)，由A、B、C、D、E 5個環(huán)相連接，在B 環(huán)和E 環(huán)均有1 個NPA 基序結(jié)構(gòu)。鑒于GsPIP2；7 蛋白具有與其他GsPIPs 不同的獨(dú)特蛋白結(jié)構(gòu)，并且GsPIP2；7在干旱脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，是上調(diào)表達(dá)最高的基因，故將其作為候選基因，研究該基因在干旱脅迫下的功能。

圖1 干旱脅迫處理后野生大豆GsPIPs基因表達(dá)聚類分析Fig.1 The cluster analysis of GsPIPs in wild soybean under drought stress

圖2 野生大豆GsPIPs蛋白結(jié)構(gòu)域及重要結(jié)構(gòu)域基序預(yù)測結(jié)果Fig.2 Prediction results of GsPIPs proteins domain and domain motif of wild soybean

2.2 GsPIP2;7基因過表達(dá)擬南芥后代篩選

轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株真葉長出，而陰性苗的子葉黃化，真葉不能展開，生長停滯（電子附圖2）。對T1和T2代轉(zhuǎn)基因植株陽、陰性分離比進(jìn)行卡方測驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽、陰性分離比均符合孟德爾遺傳規(guī)律3∶1 的比例，說明外源基因?yàn)閱物@性基因，遺傳規(guī)律遵循孟德爾分離定律。

表1 GsPIP2；7基因過表達(dá)擬南芥抗性篩選分離比Table 1 Isolation ratio of resistance identification in GsPIP2；7 overexpressed Arabidopsis thaliana

2.3 GsPIP2;7基因過表達(dá)擬南芥的生長指標(biāo)測定

干旱脅迫4 d后，野生型擬南芥的葉片黃化失綠并且萎蔫，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片邊緣開始卷曲，仍然保持綠色（圖3）。

圖3 干旱脅迫下野生型（A）與GsPIP2；7基因過表達(dá)（B）擬南芥的表型對比Fig.3 Phenotypic comparison between wild-type（A） and GsPIP2；7 overexpressed（B） Arabidopsis thaliana with drought stress

干旱脅迫7 d后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系總長度是野生型的1.42 倍，達(dá)到顯著水平，根系表面積和總根體積與野生型之間無顯著差異（表2、電子附圖3）。轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉干重、根干重、單株葉面積及根冠比均顯著高于野生型擬南芥。

表2 干旱脅迫后GsPIP2；7基因過表達(dá)擬南芥與野生型擬南芥生長指標(biāo)差異Table 2 Differences of growth indexes between GsPIP2；7 overexpressed and wild-type Arabidopsis thaliana with drought stress

2.4 GsPIP2;7 基因過表達(dá)擬南芥的基因表達(dá)及生理指標(biāo)測定

對干旱脅迫下過表達(dá)擬南芥的GsPIP2；7基因表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，過表達(dá)植株的GsPIP2；7基因表達(dá)量在干旱脅迫下的各個時間點(diǎn)均顯著上調(diào)（圖4-A）。為進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥在干旱脅迫下的生理差異，對氧化酶清除酶系（POD、CAT、SOD）酶活性進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的POD 活性在干旱脅迫后12、24和48 h均顯著升高，CAT 活性在干旱脅迫后12 和24 h 顯著升高，SOD 活性在干旱脅迫后48 h 顯著升高（圖4-B、C、F）。MDA 含量反映細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平，對其進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的MDA 含量在干旱脅迫后48 h才有所增加，而野生型擬南芥的MDA 含量在12 h即快速升高，并且在12、24 和48 h 均較轉(zhuǎn)基因植株顯著增加（圖4-D）。

圖4 干旱脅迫下GsPIP2；7基因過表達(dá)擬南芥與野生型的GsPIP2；7基因相對表達(dá)量，SOD、CAT及POD活性，MDA及葉綠素含量比較Fig.4 The GsPIP2；7 gene relative expression，SOD，POD and CAT activity，MDA and chlorophyll content of GsPIP2；7 overexpressed and wild-type Arabidopsis thaliana with drought stress

鑒于轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫后4 d 葉片仍保持綠色（圖3），對其在干旱脅迫后的葉綠素含量進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量降低速度更加緩慢，在干旱脅迫后24 和48 h 葉綠素含量差異達(dá)到顯著水平（圖4-E）。

3 討論

水通道蛋白AQPs 屬于主嵌入蛋白（major intrinsic protein，MIP）家族，廣泛分布于植物、動物和微生物中，是調(diào)節(jié)水及小分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的重要通道，對生物的正常生長具有重要作用［3］。Zhang 等［11］研究報(bào)道了野生大豆中存在的62 個AQPs，包括15 個NIPs、19 個PIPs、21個TIPs和7個SIPs。本研究在野生大豆中鑒定到69個AQPs。與Zhang等［11］的研究結(jié)果相比，新鑒定的AQPs包括2個NIPs、6個PIPs、2個TIPs和4個XIPs。本研究鑒定到7 個類SIPs（SIPs-like）蛋白結(jié)構(gòu)的野生大豆蛋白，由于這些SIPs-like 蛋白不含有典型的6 個跨膜結(jié)構(gòu)域，故本研究未將其歸為野生大豆的AQPs。

目前，關(guān)于干旱脅迫下植物AQPs基因表達(dá)的研究報(bào)道較多［22-25］。如葡萄（Vitis vinifera）在干旱脅迫下VvPIP1；1表達(dá)量顯著上調(diào)，而VvPIP2；2表達(dá)量保持不變［20］。擬南芥在干旱脅迫下的AQPs基因表達(dá)模式有很大差異，如AtPIP2；5始終上調(diào)表達(dá)（脅迫后4、12、24、48 h），AtPIP1；5、AtPIP2；3、AtPIP2；4和AtPIP2；6始終下調(diào)表達(dá)，而AtPIP1；1和AtPIP1；2則是先上調(diào)表達(dá)（脅迫后4 和12 h）后下調(diào)表達(dá)（24 和48 h）［26］。水稻在干旱脅迫下OsPIP1；1和OsPIP1；2基因表達(dá)量上調(diào)，而全部的OsPIP2s基因均表現(xiàn)為下調(diào)［27］。以上研究結(jié)果均說明，干旱脅迫下植物AQPs基因表達(dá)模式比較復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果類似，干旱脅迫下野生大豆GsPIPs基因有兩種主要表達(dá)模式：一種是“上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)”表達(dá)模式，另一種是“下調(diào)-上調(diào)”表達(dá)模式。這進(jìn)一步說明了干旱脅迫下植物AQPs基因表達(dá)受到復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，但AQPs基因在植株抗旱中的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

鑒于植物中的AQPs基因數(shù)量較多，研究單個AQP基因功能成為揭示AQPs基因功能的突破口。前人在擬南芥中和小麥（Triticum aestivum）中分別過表達(dá)珠美海棠（Malus zumi）、蘋果（Malus domestica）和小麥的PIP2；1基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的干旱脅迫和鹽脅迫抗性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因小麥在干旱和鹽脅迫下的CAT、SOD活性增加，MDA 含量較低，推測這是其比野生型植株生存能力更強(qiáng)的原因［28-30］。Zhang 等［31］關(guān)于柳枝稷（Panicum virgatum）PvPIP2；9基因的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，基因過表達(dá)植株在干旱脅迫下表現(xiàn)出更高的株高、葉長、地上生物量、纖維素含量和蛋白質(zhì)含量，說明PIPs基因?qū)χ参锬透珊得{迫具有正向調(diào)控作用。此外，關(guān)于植物PIP2；7基因功能也有一些報(bào)道。如Khan 等［32］在擬南芥中過表達(dá)了麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）的JcPIP2；7基因，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株在鹽和干旱脅迫下的根長增加，并在復(fù)水后能夠正常生長，表現(xiàn)出比野生型植株更強(qiáng)的抗鹽和抗干旱脅迫，Pou 等［33］也得到了相似的研究結(jié)果。本研究在擬南芥中過表達(dá)了野生大豆GsPIP2；7基因，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，過表達(dá)植株在干旱脅迫下的根長更長，活性氧清除酶系的酶活性保持較高水平，這可能與細(xì)胞中較低的MDA含量有關(guān)。并且過表達(dá)植株的葉片保持綠色，葉綠素含量降低速率較慢，這都顯示出過表達(dá)植株對干旱脅迫表現(xiàn)更強(qiáng)的抗性。以上結(jié)果說明GsPIP2；7基因在野生大豆耐干旱脅迫中發(fā)揮正向調(diào)控作用，但其他AQPs基因是否發(fā)揮了相同的功能尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究鑒定到69個野生大豆AQPs蛋白，其中2個NIPs、6 個PIPs、2 個TIPs 和4 個XIPs 為新鑒定AQPs 蛋白；分析了干旱脅迫下高抗干旱野生大豆材料的AQPs基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)AQPs基因主要有“上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)”和“下調(diào)-上調(diào)”兩種表達(dá)模式。在擬南芥中過表達(dá)了野生大豆GsPIP2；7基因，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株在干旱脅迫下的根系總長度更長，活性氧清除酶系活性較高，MDA 含量較低，葉綠素含量降低速率較慢，表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱脅迫耐性水平。