王 宇 趙 圓 王艷麗 俎天嬌 司增志 孫偉明 喬亞科 張 鍇
(河北科技師范學(xué)院,河北省作物逆境生物學(xué)重點實驗室(籌),河北 秦皇島 066004)
水通道蛋白(a quaporins,AQPs)是植物中運輸水分及其他小分子物質(zhì)的重要通道,存在于所有真核生物和大多數(shù)原核生物中[1]。在高等植物中,AQPs 由6個高度保守的α-螺旋構(gòu)成跨膜結(jié)構(gòu),通過A、B、C、D、E 5 個環(huán)相連接。水通道蛋白的B 環(huán)和E 環(huán)具有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala,NPA)獨特結(jié)構(gòu)。B 環(huán)和E 環(huán)各自形成半個跨膜螺旋,圍繞形成狹窄的水孔,形成水通道蛋白的“水漏”結(jié)構(gòu)模型[2]。
根據(jù)AQPs 在細胞內(nèi)的位置可分為7 個亞族:質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsicproteins,PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)、類根瘤素26(NOD26)膜蛋白(nodulin-26 like intrinsic proteins,NIPs)、膜內(nèi)在小分子堿性蛋白(small basic intrinsic proteins,SIPs)、類GlpF 膜內(nèi)在蛋白(GlpF-like intrnsic proteins,GIPs)、混合內(nèi)在蛋白(hybrid intrinsic proteins,HIPs)和未鑒定的膜內(nèi)在蛋白(X intrinsic proteins,XIPs)[3]。PIPs 存在于細胞質(zhì)膜上,分為PIP1和PIP2 兩個亞類;TIPs 有α、β、γ、δ、和ε 五個亞類,分別存在于不同液泡膜上[4];NIPs 位于質(zhì)膜和細胞內(nèi)膜上,分為NOD26和LIP2兩個亞類;SIPs位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,分為SIP1 和SIP2 兩個亞類,可促進水分運輸[5];GIPs和HIPs 僅存在于小立碗蘚(Physcomitrella patens)等幾種苔蘚植物中[6]。
目前,在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中已發(fā)現(xiàn)35 個AQPs[7]、玉米(Zea mays)中36 個AQPs[8]、水稻(Oryza sativa)中33 個AQPs[9]、栽培大豆(Glycine max)中72個AQPs[10]、野生大豆(Glycine soja)中鑒定了62個AQPs[11]。前人研究結(jié)果說明水通道蛋白PIPs基因亞家族在植物對抗干旱、鹽脅迫等非生物脅迫時具有正向調(diào)控作用[11-16]。但是也有一些不同研究結(jié)果的報道,如Wang等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)過表達野生大豆GsPIP2;1和GsTIP2;1的轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性降低。此外,干旱脅迫下,不同植物中的PIPs基因表達量也不同[19-20]。以上研究結(jié)果表明,植物AQPs的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達調(diào)控比較復(fù)雜,AQPs在調(diào)控植株非生物脅迫中的功能尚需進一步研究。
本課題組(河北科技師范學(xué)院野生大豆資源課題組)前期篩選到耐旱性強的野生大豆材料永46,對其干旱脅迫后的基因轉(zhuǎn)錄組進行了研究,發(fā)現(xiàn)與敏感材料相比,高耐旱野生大豆材料在干旱脅迫后AQPs基因存在顯著上調(diào)或下調(diào)表達。為了進一步明確AQPs 在野生大豆抗旱反應(yīng)中的分子功能,本研究對野生大豆中的AQPs 蛋白結(jié)構(gòu)進行分析,研究耐旱野生大豆材料的AQPs基因在干旱脅迫后的基因轉(zhuǎn)錄譜;通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在擬南芥中過表達GsPIP2;7基因,分析基因過表達植株與野生型在干旱脅迫下的耐旱能力差異,以期明確野生大豆中AQPs基因在干旱脅迫中的表達情況,揭示GsPIP2;7在野生大豆耐干旱脅迫中的調(diào)控功能,為培育耐旱栽培大豆奠定理論基礎(chǔ)。
高耐旱野生大豆材料永46 由河北科技師范學(xué)院野生大豆資源課題組提供。由于野生大豆籽粒外覆泥漿膜,播種之前需用小刀切種,切種在野生大豆籽粒種臍背面進行,避免破壞種臍。切種后的野生大豆籽粒播種于鋪滿營養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中,上覆薄層蛭石。培養(yǎng)缽置于溫度25 ℃(白天)/15 ℃(晚上)、日照長度14 h的溫室中。野生大豆植株生長21 d 后,在營養(yǎng)缽中倒入300 mL 濃度為20%的PEG 6000 模擬干旱脅迫處理。干旱脅迫后分別在0(未干旱脅迫,對照)、6、12、24和48 h后隨機取野生大豆材料葉片1 g,迅速保存于液氮中,作為轉(zhuǎn)錄組分析的樣本。所有樣品設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。
永46 在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄譜由華大基因(北京)進行測序。提取野生大豆葉片RNA,構(gòu)建cDNA 文庫,利用BGISEQ-500 平臺進行測序。利用Trimmomatic 0.36 軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾,HISAT2 2.1.0 軟件比對野生大豆(Glycine soja)參考基因序列。通過華大基因交互系統(tǒng)(https://report.bgi.com/ps/login/login.html)篩選在干旱脅迫后顯著變化(|log2FoldChange|>1.5)的AQPs基因,基因表達量采用FPKM(Fregments Per Kilobase per Million)法進行計算,利用Heml 1.0.3.7 軟件對取對數(shù)值(log2)的基因表達量進行聚類分析,利用MEME(http://alternate.meme-suite.org/tools/meme)在線分析工具進行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測,利用TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)在線分析工具進行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。
提取液氮保存的野生大豆材料永46的葉片RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后,利用引物F(5′→3′):GCTCTAGAA TGGCTAAAGATGTTGAGG/R(3′→5′):AGGCCCGGGT TAAGCGTTGCTTCTGAAG 擴增GsPIP2;7基因(glysoja_008314)。擴增的基因連接到pMD18 載體(D101A,寶生物工程有限公司,大連)上,后轉(zhuǎn)到表達載體pCHAC(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)上,以pCHAC::GsPIP2;7陽性載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。擬南芥Columbia-0 生態(tài)型為受體,待植株生長至抽苔狀態(tài),將擬南芥的花蕾部位置于含有農(nóng)桿菌滲透液中浸花5 min,將擬南芥植株在黑暗條件下培養(yǎng)24 h 后正常培養(yǎng),獲得T0代轉(zhuǎn)基因材料。收獲T0代種子種植,對生長的T1代轉(zhuǎn)基因材料進行潮霉素抗性篩選,即在含有20 mg·L-1潮霉素的MS 培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行抗性篩選。培養(yǎng)7 d后,待擬南芥2 片子葉展開,將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無抗生素的MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng),收獲陽性后代轉(zhuǎn)基因材料。T2代轉(zhuǎn)基因材料篩選方法同T1代材料,最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因材料。
轉(zhuǎn)基因植株GsPIP2;7基因表達量的測定參照王宇等[21]的方法。T3代純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的種植及干旱處理方法同1.1。取轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥材料植株葉片提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板,以擬南芥的Actin基因作為內(nèi)參基因,所用引物如下:GsPIP2;7基因引物F(5′→3′):GTCGTTGA TAAGGGCGTTGT/R(3′→5′):GCACCCAAAGCAGTACCA TT;Actin基因引物F(5′→3′):TGGAATCCACGAGACA ACCTA/R(3′→5′):TTCTGTGAACGATTCCTGGA。采用One Step SYBR?PrimeScript? RT-PCR Kit 試劑盒(RR066A,寶生物工程有限公司,大連)進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)反應(yīng),利用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀(伯樂,美國)測定目的基因及內(nèi)參基因的Ct 值。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。
干旱脅迫后7 d進行干物質(zhì)重和葉面積測定;利用根系分析系統(tǒng)進行植株根系測定;干旱脅迫后0 h(未干旱脅迫,對照)、12、24 和48 h 后取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥同一葉位的葉片測定如下生理指標:利用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)光還原比色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;利用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(peroxidase,POD)活性;利用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)比色法測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;利用80%丙酮比色法測定葉綠素含量;利用過氧化氫酶測定試劑盒(A007-1-1,南京建成生物工程研究所)測定過氧化氫酶(catalase,CAT)活性。
應(yīng)用SAS 9.2 統(tǒng)計軟件進行各處理的差異顯著性分析,以P<0.05為顯著水平。
通過野生大豆轉(zhuǎn)錄組分析的基因注釋結(jié)果,鑒定到野生大豆中的69個GsAQPs基因。對69個GsAQPs基因所屬亞族進行分析,發(fā)現(xiàn)15個屬于NIPs亞族,25個屬于PIPs 亞族,23 個屬于TIPs 亞族,6 個屬于XIPs 亞族。對69 個GsAQPs 蛋白結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)全部GsAQPs蛋白均含有2 個NPA 基序結(jié)構(gòu),同一亞族中的蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域,如所有的GsPIPs 均具有質(zhì)膜水孔蛋白的保守結(jié)構(gòu)域GGGANXXXXGY,但在其他亞族蛋白中均不含有此結(jié)構(gòu)域,說明GsAQP 蛋白具有一定的保守性,并且各個亞族保守性存在差異(電子附圖1)。
在干旱脅迫下,抗旱野生大豆材料中有10 個GsPIPs基因表達差異達到顯著水平(圖1)。10 個差異表達GsPIPs基因有兩種表達模式:處理后6 和24 h 顯著上調(diào)表達,GsPIP1;9、GsPIP1;12、GsPIP2;8、GsPIP2;7屬于此種表達模式;處理后先下調(diào)表達,至24 h后上調(diào)表達,GsPIP2;2、GsPIP2;3、GsPIP1;4基因?qū)儆诖朔N表達模式。對10 個差異表達GsPIPs基因的蛋白結(jié)構(gòu)進行分析(圖2),發(fā)現(xiàn)除GsPIP2;7 外,其余9 個GsPIPs 蛋白均有6個跨膜結(jié)構(gòu),由A、B、C、D、E 5個環(huán)相連接,在B 環(huán)和E 環(huán)均有1 個NPA 基序結(jié)構(gòu)。鑒于GsPIP2;7 蛋白具有與其他GsPIPs 不同的獨特蛋白結(jié)構(gòu),并且GsPIP2;7在干旱脅迫下顯著上調(diào)表達,是上調(diào)表達最高的基因,故將其作為候選基因,研究該基因在干旱脅迫下的功能。
圖1 干旱脅迫處理后野生大豆GsPIPs基因表達聚類分析Fig.1 The cluster analysis of GsPIPs in wild soybean under drought stress
圖2 野生大豆GsPIPs蛋白結(jié)構(gòu)域及重要結(jié)構(gòu)域基序預(yù)測結(jié)果Fig.2 Prediction results of GsPIPs proteins domain and domain motif of wild soybean
轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株真葉長出,而陰性苗的子葉黃化,真葉不能展開,生長停滯(電子附圖2)。對T1和T2代轉(zhuǎn)基因植株陽、陰性分離比進行卡方測驗,結(jié)果如表1 所示。轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽、陰性分離比均符合孟德爾遺傳規(guī)律3∶1 的比例,說明外源基因為單顯性基因,遺傳規(guī)律遵循孟德爾分離定律。
表1 GsPIP2;7基因過表達擬南芥抗性篩選分離比Table 1 Isolation ratio of resistance identification in GsPIP2;7 overexpressed Arabidopsis thaliana
干旱脅迫4 d后,野生型擬南芥的葉片黃化失綠并且萎蔫,轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片邊緣開始卷曲,仍然保持綠色(圖3)。
圖3 干旱脅迫下野生型(A)與GsPIP2;7基因過表達(B)擬南芥的表型對比Fig.3 Phenotypic comparison between wild-type(A) and GsPIP2;7 overexpressed(B) Arabidopsis thaliana with drought stress
干旱脅迫7 d后,轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系總長度是野生型的1.42 倍,達到顯著水平,根系表面積和總根體積與野生型之間無顯著差異(表2、電子附圖3)。轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉干重、根干重、單株葉面積及根冠比均顯著高于野生型擬南芥。
表2 干旱脅迫后GsPIP2;7基因過表達擬南芥與野生型擬南芥生長指標差異Table 2 Differences of growth indexes between GsPIP2;7 overexpressed and wild-type Arabidopsis thaliana with drought stress
對干旱脅迫下過表達擬南芥的GsPIP2;7基因表達量進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型相比,過表達植株的GsPIP2;7基因表達量在干旱脅迫下的各個時間點均顯著上調(diào)(圖4-A)。為進一步明確轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥在干旱脅迫下的生理差異,對氧化酶清除酶系(POD、CAT、SOD)酶活性進行了測定,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株的POD 活性在干旱脅迫后12、24和48 h均顯著升高,CAT 活性在干旱脅迫后12 和24 h 顯著升高,SOD 活性在干旱脅迫后48 h 顯著升高(圖4-B、C、F)。MDA 含量反映細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平,對其進行測定發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株的MDA 含量在干旱脅迫后48 h才有所增加,而野生型擬南芥的MDA 含量在12 h即快速升高,并且在12、24 和48 h 均較轉(zhuǎn)基因植株顯著增加(圖4-D)。
圖4 干旱脅迫下GsPIP2;7基因過表達擬南芥與野生型的GsPIP2;7基因相對表達量,SOD、CAT及POD活性,MDA及葉綠素含量比較Fig.4 The GsPIP2;7 gene relative expression,SOD,POD and CAT activity,MDA and chlorophyll content of GsPIP2;7 overexpressed and wild-type Arabidopsis thaliana with drought stress
鑒于轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫后4 d 葉片仍保持綠色(圖3),對其在干旱脅迫后的葉綠素含量進行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量降低速度更加緩慢,在干旱脅迫后24 和48 h 葉綠素含量差異達到顯著水平(圖4-E)。
水通道蛋白AQPs 屬于主嵌入蛋白(major intrinsic protein,MIP)家族,廣泛分布于植物、動物和微生物中,是調(diào)節(jié)水及小分子物質(zhì)進出細胞的重要通道,對生物的正常生長具有重要作用[3]。Zhang 等[11]研究報道了野生大豆中存在的62 個AQPs,包括15 個NIPs、19 個PIPs、21個TIPs和7個SIPs。本研究在野生大豆中鑒定到69個AQPs。與Zhang等[11]的研究結(jié)果相比,新鑒定的AQPs包括2個NIPs、6個PIPs、2個TIPs和4個XIPs。本研究鑒定到7 個類SIPs(SIPs-like)蛋白結(jié)構(gòu)的野生大豆蛋白,由于這些SIPs-like 蛋白不含有典型的6 個跨膜結(jié)構(gòu)域,故本研究未將其歸為野生大豆的AQPs。
目前,關(guān)于干旱脅迫下植物AQPs基因表達的研究報道較多[22-25]。如葡萄(Vitis vinifera)在干旱脅迫下VvPIP1;1表達量顯著上調(diào),而VvPIP2;2表達量保持不變[20]。擬南芥在干旱脅迫下的AQPs基因表達模式有很大差異,如AtPIP2;5始終上調(diào)表達(脅迫后4、12、24、48 h),AtPIP1;5、AtPIP2;3、AtPIP2;4和AtPIP2;6始終下調(diào)表達,而AtPIP1;1和AtPIP1;2則是先上調(diào)表達(脅迫后4 和12 h)后下調(diào)表達(24 和48 h)[26]。水稻在干旱脅迫下OsPIP1;1和OsPIP1;2基因表達量上調(diào),而全部的OsPIP2s基因均表現(xiàn)為下調(diào)[27]。以上研究結(jié)果均說明,干旱脅迫下植物AQPs基因表達模式比較復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果類似,干旱脅迫下野生大豆GsPIPs基因有兩種主要表達模式:一種是“上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)”表達模式,另一種是“下調(diào)-上調(diào)”表達模式。這進一步說明了干旱脅迫下植物AQPs基因表達受到復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,但AQPs基因在植株抗旱中的調(diào)控機制還需進一步研究。
鑒于植物中的AQPs基因數(shù)量較多,研究單個AQP基因功能成為揭示AQPs基因功能的突破口。前人在擬南芥中和小麥(Triticum aestivum)中分別過表達珠美海棠(Malus zumi)、蘋果(Malus domestica)和小麥的PIP2;1基因,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的干旱脅迫和鹽脅迫抗性增強,轉(zhuǎn)基因小麥在干旱和鹽脅迫下的CAT、SOD活性增加,MDA 含量較低,推測這是其比野生型植株生存能力更強的原因[28-30]。Zhang 等[31]關(guān)于柳枝稷(Panicum virgatum)PvPIP2;9基因的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),基因過表達植株在干旱脅迫下表現(xiàn)出更高的株高、葉長、地上生物量、纖維素含量和蛋白質(zhì)含量,說明PIPs基因?qū)χ参锬透珊得{迫具有正向調(diào)控作用。此外,關(guān)于植物PIP2;7基因功能也有一些報道。如Khan 等[32]在擬南芥中過表達了麻風樹(Jatropha curcas)的JcPIP2;7基因,發(fā)現(xiàn)過表達植株在鹽和干旱脅迫下的根長增加,并在復(fù)水后能夠正常生長,表現(xiàn)出比野生型植株更強的抗鹽和抗干旱脅迫,Pou 等[33]也得到了相似的研究結(jié)果。本研究在擬南芥中過表達了野生大豆GsPIP2;7基因,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,過表達植株在干旱脅迫下的根長更長,活性氧清除酶系的酶活性保持較高水平,這可能與細胞中較低的MDA含量有關(guān)。并且過表達植株的葉片保持綠色,葉綠素含量降低速率較慢,這都顯示出過表達植株對干旱脅迫表現(xiàn)更強的抗性。以上結(jié)果說明GsPIP2;7基因在野生大豆耐干旱脅迫中發(fā)揮正向調(diào)控作用,但其他AQPs基因是否發(fā)揮了相同的功能尚需進一步研究。
本研究鑒定到69個野生大豆AQPs蛋白,其中2個NIPs、6 個PIPs、2 個TIPs 和4 個XIPs 為新鑒定AQPs 蛋白;分析了干旱脅迫下高抗干旱野生大豆材料的AQPs基因表達模式,發(fā)現(xiàn)差異表達AQPs基因主要有“上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)”和“下調(diào)-上調(diào)”兩種表達模式。在擬南芥中過表達了野生大豆GsPIP2;7基因,發(fā)現(xiàn)過表達植株在干旱脅迫下的根系總長度更長,活性氧清除酶系活性較高,MDA 含量較低,葉綠素含量降低速率較慢,表現(xiàn)出較強的干旱脅迫耐性水平。