沈樂意 王錦陽 陳天池 周偉軍 徐 濤 顧一凡 吳月燕，

（1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2浙江大學(xué)紫金港校區(qū)農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

我國是葡萄屬（VitisL.）植物基因起源中心之一，全球葡萄屬植物種類的60%產(chǎn)于中國［1］。葡萄具有非常高的營養(yǎng)價值，在抗衰老、緩解疲勞以及預(yù)防血栓等方面發(fā)揮著功效［2］。果實品質(zhì)一直是葡萄研究的熱點，在生產(chǎn)實踐中葡萄果實品質(zhì)評價與成熟期的確定均與果實中糖的含量有關(guān)。

糖異生（gluconeogenesis）途徑是非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的過程［3］。在植物中糖異生的代謝途徑主要有兩部分（圖1）。第一部分有兩條平行的代謝通路：第一條代謝途徑從草酰乙酸（oxaloacetic acid，OAA）開始在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）及腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）及腺嘌呤核苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）［4-5］；第二條代謝途徑從丙酮酸（或其脂類及鹽類衍生物）開始在丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase，PPDK）及ATP 的作用下生成PEP 及腺嘌呤核苷單磷酸（adenosine monophosphate，AMP）［6］。由于兩條途徑生成的產(chǎn)物皆為PEP，所以糖異生在第二部分合并為單一途徑，即1，6-二磷酸果糖在1，6-二磷酸果糖酶（fructose-1，6-bisphosphatase，F(xiàn)BP）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6P）等作用下生成葡萄糖及其他糖類物質(zhì)［7-8］。因此，本試驗從糖異生途徑的相關(guān)基因中選擇了PEPCK、PPDK、FBP以及G6P四個基因進(jìn)行研究。

圖1 糖異生途徑生成糖［7］Fig.1 Sugar production by gluconeogenesis pathway［7］

澆灌營養(yǎng)液是設(shè)施葡萄栽培管理中比較常見的提高果實品質(zhì)的措施，Abo-Ahmedeh等［9］研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)液的施用可以提高葡萄果實中可溶性固形物的含量。Li 等［10］在番茄中研究發(fā)現(xiàn)，溫度、濕度等環(huán)境因素會影響果實品質(zhì)，但大量前人研究表明肥料供應(yīng)是影響果實風(fēng)味的最重要因素［11-13］，且有機(jī)肥在改善果實品質(zhì)方面比無機(jī)營養(yǎng)液更有效［14-15］。但近年來在葡萄肥料方面的研究主要集中在N、P、K 肥等單一肥料上，對一些新型的水溶性肥料研究較少［16］。

因此，本研究以鄞紅葡萄為試驗材料，在葡萄果實第二次膨大期澆灌自主配置的3 種營養(yǎng)液，分別是僅單一含有S、K肥的營養(yǎng)液A，含有Ga、Mg、P、Na等更多無機(jī)肥的營養(yǎng)液B，以及有機(jī)無機(jī)復(fù)合的新型水肥營養(yǎng)液C。以澆灌蒸餾水為對照，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)分別檢測葡萄果肉中糖含量和糖異生途徑相關(guān)基因的表達(dá)量，分析果實中糖分形成與糖異生相關(guān)基因表達(dá)量的關(guān)系，以期為進(jìn)一步深入研究糖異生相關(guān)基因調(diào)控葡萄果實糖分的形成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗材料取自浙江省寧波市鎮(zhèn)海區(qū)葡萄試驗基地（30°N，121°E）。該葡萄園年平均溫度16.9 ℃，年均降水量1 374 mm，其中75%的降水量集中在上半年，年均日照時數(shù)2 057 h。土層深度102 cm，地下水位55～60 cm，土壤為粘質(zhì)土，有機(jī)質(zhì)25 g·kg-1，堿性氮202 mg·kg-1，速效磷35 mg·kg-1，速效鉀114 mg·kg-1，土壤容重112.3 g·cm-3，pH值6.4。試驗所用鄞紅葡萄定植于同一連棟式大棚內(nèi)，大棚面積為6 668 m2左右，4 年生植株。試驗期間無裙膜，頂部覆蓋無色聚氯乙烯無滴膜，行株距2～3 m，溝深30 cm，寬35 cm，每行定植60株。

試驗共設(shè)3個處理：T1根系澆灌營養(yǎng)液A、T2根系澆灌營養(yǎng)液B、T3 根系澆灌營養(yǎng)液C，營養(yǎng)液具體成分見表1。5株為一個小區(qū)，隨機(jī)排列，重復(fù)3次。于果實第二次膨大期（2020 年5 月24 日）進(jìn)行第一次處理，之后每隔7 d再進(jìn)行一次處理（5 月31日、6 月7日），共處理3次。每次處理取不同的營養(yǎng)液10 L對每個小區(qū)進(jìn)行根系澆灌，使用等體積的蒸餾水澆灌作為對照組CK，其他管理保持一致。在營養(yǎng)液澆灌3 次后0、15、25、35 和40 d 分別在處理組與對照組中隨機(jī)采集形態(tài)相近的葡萄果實各9 穗，其中3 穗鮮樣用于成熟期判定，剩余樣品存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)試驗。

表1 營養(yǎng)液成分表Table1 Nutrient solution composition table /（mg·L-1）

1.2 鄞紅葡萄漿果成熟期判定

蔬果的果皮顏色常與果實中可溶性固形物含量相關(guān)聯(lián)，生產(chǎn)實踐中常利用直觀的表皮顏色變化來判斷蔬果的成熟度［17-18］。本研究通過測定葡萄果實的紅綠值來判斷果實的成熟期。每個時期隨機(jī)取3 穗果實，每穗果實頂端、中間和底部隨機(jī)取15 粒漿果，測定部位需涵蓋整個果實，包括4 個側(cè)面和底部。參照文獻(xiàn)［19］的方法采用CR-400便攜式色差儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）測定葡萄果實色差，計算每粒葡萄果實的紅綠值（a*）：當(dāng)a*≤0時，認(rèn)定該葡萄果實屬于綠色未進(jìn)行轉(zhuǎn)色，當(dāng)0＜a*＜15 時，認(rèn)定該葡萄果實開始進(jìn)入轉(zhuǎn)色期。當(dāng)15≤a*＜20 時認(rèn)定其轉(zhuǎn)色完成，當(dāng)a*≥20 時認(rèn)定其成熟過度，達(dá)到了過成熟期。在生產(chǎn)實踐中，當(dāng)一穗葡萄中未轉(zhuǎn)色漿果小于5%，成熟與過成熟漿果大于70%時，表示已經(jīng)成熟，達(dá)到了上市標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 果實糖含量的測定

處理與對照每組隨機(jī)選取形態(tài)相近的3 穗果，每穗選取9粒果實，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗。糖分的前處理與色譜條件參考文獻(xiàn)［20］的方法。預(yù)先將離心管、藥匙、研缽用液氮進(jìn)行冷卻，水浴鍋進(jìn)行80 ℃預(yù)熱。從-80 ℃冰箱中取出樣品剝皮，取適量果肉放入研缽中加入液氮迅速研磨成粉末后稱取3次1 g粉末于3個離心管中，加入5 mL雙蒸水后震蕩混勻。在80 ℃的水浴鍋中水浴加熱30 min，冷卻至室溫后放至離心機(jī)中以25 ℃、4 200 r·min-1條件下離心30 min，取5 mL上清液于新的干燥離心管中。在濾渣中加入4 mL 雙蒸水重復(fù)提取一次，合并上清液，雙蒸水定容至10 mL，用0.22 μm的一次性水系濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，做好標(biāo)記，保存于4 ℃環(huán)境下，待測。高效液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH Amide 柱子（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；檢測波長210 nm；流動相乙腈：水（70：30，v/v），流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 總RNA的提取及熒光定量PCR

在NCBI 上搜索并獲取PEPCK（登錄號：XM_003635619.3）、PPDK（登錄號：XM_010651529.2）、FBP（登錄號：XM_002269194.3）和G6P（登錄號：EC366533.1）基因的序列，用Primer 5.0 設(shè)計熒光定量引物，引物由擎科合成（表2）。處理與對照每組隨機(jī)選取形態(tài)相近的3 穗果，每穗隨機(jī)選取3 粒單果，根據(jù)多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書對剝皮后的葡萄果肉進(jìn)行總RNA的提取。Spectra Max190 全波長酶標(biāo)儀（北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司）上測定RNA 濃度、OD260/280和OD260/230。以總RNA 為模板，利用cDNA 合成試劑盒（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與純化，選擇葡萄Actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL：100 ng·μL-1cDNA 0.4 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL，2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，RNase Free Water 8.8 μL。每個模板設(shè)3 次技術(shù)重復(fù)，取平均值。采用2-ΔΔCT法［21］進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences of qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過Excel 2010 進(jìn)行圖表制作，通過SPSS 19 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2022 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)液施用對葡萄果實成熟期的影響

由圖2 可知，對照組和處理組在6 月7 日均開始轉(zhuǎn)色。CK在7月17日基本完成轉(zhuǎn)色。T1在7月12日有超過50%的葡萄完成轉(zhuǎn)色，5 d 后全部轉(zhuǎn)色完成。T2在6月22 日約50%的葡萄完成轉(zhuǎn)色，7 月12 日后的葡萄呈深紫紅色。T3 在6 月22 日完成轉(zhuǎn)色的葡萄超過50%，與CK以及其他處理組相比，明顯最早完成轉(zhuǎn)色。

圖2 不同時期果實的發(fā)育狀況Fig.2 Fruit development in different periods

結(jié)合圖3可知，CK在處理后25 d加速成熟，到35 d成熟期漿果占47.06%。T1 處理組葡萄漿果成熟期的變化與CK的趨勢基本一致，但處理后35 d，T1的成熟期漿果較CK 增加了8.5個百分點。處理后40 d，T1成熟期漿果占60.87%，多于CK的54.16%。而T2用營養(yǎng)液B處理后35 d，成熟期漿果占比高達(dá)61.9%，與CK 和T1相比，T2 成熟期明顯提早。T3 在施用營養(yǎng)液C 后，未轉(zhuǎn)色的葡萄占比明顯降低。營養(yǎng)液C 處理后25 d，成熟期漿果占比超過70%，在所有處理中早熟效果最為明顯。綜上，施加營養(yǎng)液能夠在一定程度上影響葡萄的成熟期。

圖3 不同營養(yǎng)液處理對葡萄生理周期的影響Fig.3 Effect of different nutrient treatments on the physiological cycle of grapes

2.2 營養(yǎng)液的施用對葡萄果實糖含量的影響

用HPLC 對鄞紅葡萄果肉中的葡萄糖（glucose，Glu）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）和蔗糖（sucrose，Suc）含量進(jìn)行測定。圖4-A、B為Glu、Fru和Suc的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖，其中Glu的保留時間為5.85 min，F(xiàn)ru的保留時間為5.05 min，Suc 的保留時間為8.07 min。圖4-C、D為樣品色譜圖，出現(xiàn)與標(biāo)品中葡萄糖、果糖保留時間一致的峰，但保留時間8 min 附近未出現(xiàn)峰，說明樣品中不存在Suc或者Suc含量低至可以忽略，但能較好地提取并檢測到Glu 和Fru。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到Glu 的線性回歸方程：y=262.739x-28 577.0，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 4；Fru 的線性回歸方程：y=247.025x-29 939.1，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 4，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，能對樣品中的糖含量進(jìn)行定量分析。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）、果糖標(biāo)準(zhǔn)品（B）及試驗樣品（C、D）色譜圖Fig.4 Chromatogram of glucose standard （A），fructose standard （B） and test samples （C，D）

由圖5可知，在葡萄果實中，Glu含量大于Fru含量。處理后15 d 內(nèi)，Glu 和Fru 的含量急劇增長，即隨著葡萄果實的成熟而增長。到40 d 前后，果實中的Glu 和Fru 均呈略微下降趨勢，但仍比第25 天的糖含量高。不同處理對果實糖含量的影響存在差異，營養(yǎng)液A、B、C的施用均能增加葡萄果實中的糖含量，其中營養(yǎng)液C的效果最佳。在營養(yǎng)液處理后的前15 d，組間Glu含量無顯著差異，但Fru含量T3與CK相比差異顯著。25 d時，T3 的Glu 含量顯著高于CK 和T1，而Fru 含量組間無顯著差異。35 d 時，T3 的Glu 和Fru 含量均達(dá)到最大，分別為126.477 和108.966 mg·g-1。40 d 后，不同處理的Glu和Fru含量均略有下降。

圖5 營養(yǎng)液澆灌對果實葡萄糖和果糖含量的影響Fig.5 Effect of nutrient solution watering on glucose and fructose content of fruits

2.3 營養(yǎng)液的施用對糖異生相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖6 可知，在營養(yǎng)液處理后15 d 內(nèi)，糖異生相關(guān)基因的表達(dá)均上調(diào)。25 d后，PPDK和G6P的表達(dá)開始下調(diào)，而PEPCK、FBP在35 d 后才開始下調(diào)。營養(yǎng)液處理后15 d，PEPCK和FBP基因的表達(dá)明顯上調(diào)，處理組的基因表達(dá)水平顯著高于CK。處理后25 d，處理組的PEPCK、FBP和G6P基因表達(dá)水平均高于CK，其中T3的糖異生相關(guān)基因PEPCK、PPDK、FBP和G6P的表達(dá)量均達(dá)到營養(yǎng)液處理后40 d 內(nèi)的最大值。結(jié)合圖5 分析可知，當(dāng)T3 的糖異生相關(guān)基因表達(dá)水平達(dá)到峰值后，Glu、Fru 含量開始大幅度增長。35 d 時，T3 的Glu、Fru 含量達(dá)到最大，PEPCK、PPDK、FBP和G6P的表達(dá)開始下調(diào)，糖含量隨之降低。但T1、T2 的糖異生相關(guān)基因調(diào)控Glu、Fru含量無明顯規(guī)律，推測T1、T2基因表達(dá)的峰值可能出現(xiàn)在25～35 d之間。處理后40 d，CK 的PEPCK和FBP的表達(dá)水平均高于T2、T3，而PPDK和G6P的表達(dá)水平與處理組相比無顯著差異。

圖6 營養(yǎng)液澆灌對果實糖異生相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of nutrient solution watering on the expression of glucose xenobiotic-related genes in fruits

圖7 不同處理下果實糖含量與糖異生相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of fruit sugar content and expression of gluconeogenesis-related genes under different treatments

2.4 果肉中糖含量與糖異生相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

葡萄果肉糖含量與糖異生相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明，在果實成熟過程中，糖分的形成與糖異生相關(guān)基因的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。CK 的PEPCK基因表達(dá)量與Glu、Fru 含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.99和1.00，Glu與Fru含量的相關(guān)系數(shù)為1.00。T1中PEPCK和FBP基因與Glu含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.97和0.91，同時與Fru含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.98和0.90。而PPDK與G6P的表達(dá)量之間呈顯著正相關(guān)，與葡萄糖、果糖含量的相關(guān)性均不顯著。T2中FBP基因的表達(dá)量與Glu、Fru含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.93和0.91，但PEPCK基因的表達(dá)量僅與Fru含量呈顯著正相關(guān)。T3中僅FBP基因與Glu、Fru含量呈顯著正相關(guān)，PEPCK基因的表達(dá)量與Glu、Fru 含量的相關(guān)性不顯著。綜上，PEPCK、FBP、PPDK和G6P基因表達(dá)與糖含量均呈正相關(guān)，但PEPCK和FBP與糖含量相關(guān)系數(shù)更高。其中CK、T1中PEPCK的表達(dá)量與葡萄糖、果糖呈顯著正相關(guān)，T1、T2、T3中FBP的表達(dá)量與葡萄糖、果糖呈顯著正相關(guān)。與CK相比，施用營養(yǎng)液后FBP的表達(dá)與Glu、Fru含量的相關(guān)性更強。

3 討論

在多肉水果中，可溶性糖是果實生長發(fā)育所必需的成分，其含量是評價果實品質(zhì)的核心指標(biāo)［22］。糖分積累是果實品質(zhì)形成的關(guān)鍵，決定了葡萄的市場價值［23］。目前，外源營養(yǎng)液的灌施是設(shè)施葡萄栽培中常見的提高果實糖含量的方式之一。本研究中，澆灌營養(yǎng)液后的葡萄果實提早轉(zhuǎn)色：施用營養(yǎng)液C 后25 d 葡萄成熟期漿果占比超過70%，Glu、Fru 的含量較CK 提高了23.17%、10.19%；35 d 時，Glu、Fru 的含量達(dá)到最高，推測適宜外源營養(yǎng)物質(zhì)的補充有助于提高果實中的糖含量，促進(jìn)果實提早成熟，這與Wu 等［24］在甘蔗中的研究結(jié)果一致。此外，灌施有機(jī)無機(jī)復(fù)合營養(yǎng)液C后25 d，與同時期CK 相比，糖異生相關(guān)基因PEPCK、PPDK、FBP、G6P的表達(dá)均顯著上調(diào)，且施加營養(yǎng)液后FBP基因的表達(dá)量與Glu、Fru含量顯著相關(guān)。因此，推測外源營養(yǎng)物質(zhì)的施加還可能促進(jìn)糖異生通路中相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，糖異生相關(guān)基因的表達(dá)是代謝途徑中重要的調(diào)控因素，其中PEPCK在果實成熟過程調(diào)控糖類物質(zhì)的形成［25］，F(xiàn)BP是植物糖異生途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因，對果實發(fā)育過程中糖分合成有一定調(diào)控作用［7，26］。研究發(fā)現(xiàn)，干擾生長發(fā)育階段馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）塊莖中FBP基因的表達(dá)可造成糖含量降低［27］，與本試驗葡萄果實中FBP表達(dá)上調(diào)促進(jìn)糖含量增加的結(jié)論一致。對金桔（Citrus japonicaThunb.）、柑橘（Citrus reticulataBlanco.）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、基因組測序的結(jié)果也說明了PEPCK和FBP是可溶性糖積累差異相關(guān)的基因，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和1，6-二磷酸果糖酶參與糖類物質(zhì)的形成［28-29］。在本試驗中，糖異生相關(guān)基因的表達(dá)在施用營養(yǎng)液C 后，均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，其中PEPCK和FBP基因的表達(dá)較CK 提早10 d達(dá)到峰值。在營養(yǎng)液C處理后25 d，各基因的表達(dá)量達(dá)到最大，10 d 后，葡萄果實中Glu 和Fru 的含量達(dá)到峰值。說明施用營養(yǎng)液C 可以有效促進(jìn)PEPCK和FBP基因的表達(dá)上調(diào)，并正向調(diào)控果實中的糖含量。

在本試驗中，PPDK的表達(dá)量較糖異生其他相關(guān)基因明顯偏低，且該基因與糖含量的相關(guān)性不顯著。Walker 等［30］在櫻桃果肉中未檢測到PPDK基因的表達(dá)，F(xiàn)amiani 等［31］在赤霞珠、霞多麗以及亞歷山大麝香葡萄果皮中均未檢測到PPDK，這表明PPDK在漿果類水果中存在豐度較低，與本研究結(jié)果相符。葡萄糖-6-磷酸酶催化6-磷酸葡萄糖水解為葡萄糖和無機(jī)磷酸鹽［32］，是動物體內(nèi)平衡葡萄糖含量的一個關(guān)鍵酶，但目前在植物中鮮有研究。本研究發(fā)現(xiàn)，G6P基因在葡萄果實中高表達(dá)，隨著果實成熟G6P基因的表達(dá)水平變化不大，且G6P基因的表達(dá)量與葡萄果肉中Glu、Fru含量的相關(guān)性均不顯著，推測G6P基因在漿果類植物中沒有直接起到促進(jìn)糖類物質(zhì)形成的作用。綜上可知，外源營養(yǎng)液的施加對PPDK和G6P基因表達(dá)的影響遠(yuǎn)小于PEPCK和FBP基因，同時在果實軟化著色過程中PPDK和G6P基因表達(dá)量的變化較小。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果，即PPDK和G6P基因的表達(dá)量與糖含量的相關(guān)性較低，說明PPDK和G6P基因可能無法調(diào)控葡萄果實中的糖含量或作用較小。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，營養(yǎng)液的施用能有效提高果實成熟期的糖含量，其中有機(jī)無機(jī)復(fù)合的新型水肥營養(yǎng)液C的效果最優(yōu)。營養(yǎng)液處理顯著提高了轉(zhuǎn)色期果實中PEPCK、FBP基因的表達(dá)水平，對PPDK和G6P基因的影響不顯著。PEPCK和FBP的表達(dá)量與葡萄糖、果糖含量呈正相關(guān)。綜合來看，施用營養(yǎng)液C 后35 d 為采收鄞紅葡萄最佳時間，此時成熟與過成熟果實的果粒達(dá)94.18%，葡萄糖含量達(dá)126.477 mg·g-1，果糖含量達(dá)108.966 mg·g-1。