芮雪,張鈺,蔡杰,許紀玲,傅強,何成濤(南京紅十字血液中心,南京 210003)

Rh血型系統(tǒng)是人類紅細胞血型系統(tǒng)中最復(fù)雜的系統(tǒng),在輸血領(lǐng)域的重要性僅次于ABO血型。D抗原在Rh系統(tǒng)中免疫原性最強且與臨床密切相關(guān),是導(dǎo)致新生兒溶血病、輸血性溶血反應(yīng)等的主要原因[1]。由于Rh系統(tǒng)復(fù)雜的多態(tài)性,存在多種D變異型,如弱D、不完全弱D、部分D、Del、Rhnull 和Rhmod等[2]。大部分弱D型被認為是D抗原表位基本完整而僅D抗原數(shù)量減少,但已有一些報道指出某些弱D型(Weak D3、Weak D4、Weak D15)可以導(dǎo)致抗D抗體的產(chǎn)生[3-5]。由于不同弱D型的血清學(xué)特征差異并不顯著,無法通過血清學(xué)區(qū)分弱D分型。且目前多數(shù)學(xué)者僅對有臨床意義的弱表型進行分子生物學(xué)研究,而忽視了對弱D型基因攜帶者的分子生物學(xué)機制分析。本研究對1例血型血清學(xué)檢測為RhD弱陽性的樣本進行分子生物學(xué)檢測及家系調(diào)查分析,鑒定為弱D型54,報道如下。

1 材料與方法

1.1病歷資料 采集2022年6月由南京市兒童醫(yī)院河西分院送檢的RhD鑒定樣本。先證者(Ⅱ1),男性,5歲,江蘇南京人,因疝氣行術(shù)前檢查,RhD血清學(xué)呈弱陽性,初步鑒定為變異型。先證者父親(Ⅰ1)與母親(Ⅰ2)均為RhD陽性。先證者及其父母樣本均為EDTA-K2抗凝全血。

1.2試劑與儀器 D1試劑:單克隆 IgM+IgG抗-D試劑(加拿大宜美康生物制品公司),D2試劑:單克隆IgM/IgG抗-D試劑(英國Millipore公司),D3試劑:單克隆IgG抗-D試劑、D-SCREEN抗原表位檢測試劑盒(法國Diagast公司),O型抗篩細胞(上海血液生物醫(yī)藥公司),O型譜細胞(荷蘭Sanquin公司),低離子抗人球蛋白卡(瑞士Diamed公司),人類紅細胞RHD血型基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)公司),DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司),PCR擴增試劑(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase,日本TaKaRa公司),Qubit dsDNA BR 分析試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。免疫微柱孵育器(長春博研科學(xué)儀器公司),ID-Centrifuge 12 S Ⅱ型低離子抗人球蛋白卡孵育器、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司),MagNA Pure 24全自動核酸純化儀(瑞士Roche公司),微量紫外線核酸分析儀(德國Implen GmbH公司),Veriti7500型梯度PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3方法

1.3.1血型血清學(xué)檢測 取樣本紅細胞200 μL,用0.9%生理鹽水洗滌3次后,配置成0.8%和3%的2種紅細胞懸液,選用3種不同細胞株的單克隆IgM抗-D和IgG抗-D試劑(D1、D2、D3)分別用于鹽水試管法及抗球蛋白微柱凝膠卡法檢測D抗原;用抗球蛋白微柱凝膠卡進行直接抗球蛋白試驗、抗體篩查和抗體鑒定。排除直接抗人球蛋白試驗和不規(guī)則抗體篩查陽性后,鹽水介質(zhì)中無凝集或弱凝集,而微柱凝膠卡陽性,則稱為弱D試驗陽性。試驗均按試劑說明書操作。

1.3.2抗原表位分析 采用D-Screen試劑盒中的9種單克隆抗-D檢測弱D型標本的D抗原表位,其中IgM抗-D試劑采用鹽水試管法,IgG抗-D試劑采用抗球試管法檢測。所有試劑均按試劑及儀器說明書操作。

1.3.3分子生物學(xué)檢測

1.3.3.1PCR-SSP 取200 μL抗凝全血,按照DNA提取試劑盒說明書提取樣本的基因組DNA,并使用微量紫外線核酸蛋白分析儀測定DNA濃度和純度。DNA濃度稀釋至40～60 ng/μL, DNA純度(A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0。使用人類紅細胞RHD血型基因分型試劑盒(PCR-SSP法)進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù):96 ℃ 2 min;96 ℃ 20 s,68 ℃ 60 s,5個循環(huán);96 ℃ 20 s,65 ℃ 50 s,72 ℃ 45 s,10個循環(huán);96 ℃ 20 s,62 ℃ 50 s,72 ℃ 45 s,18個循環(huán); 72 ℃ 5 min,4 ℃保存。待PCR擴增結(jié)束,按照引物孔位圖的順序,將PCR產(chǎn)物(10 μL)轉(zhuǎn)移至2.5 g/L瓊脂糖凝膠孔中進行凝膠電泳10 min(150～180 V),凝膠成像儀拍照并觀察結(jié)果。

1.3.3.2RHD外顯子測序 將提取的DNA樣本送至江蘇中濟萬泰生物醫(yī)藥公司(采用3500 XL Dx基因分析儀檢測,美國Applied Biosystems公司)和西安浩瑞基因技術(shù)公司(采用PacBio Sequel單分子實時測序系統(tǒng))進行1～10外顯子測序,測序片段為RHDexons 1～10,對序列結(jié)果進行比對和分析。RH基因序列擴增:采用PCR擴增試劑擴增基因組DNA以及使用RH基因特異性引物進行多重PCR擴增,循環(huán)參數(shù):94 ℃ 2 min;98 ℃ 12 s,68 ℃ 12 min,27個循環(huán);68 ℃ 10 min,獲得RH基因的全長序列。PCR產(chǎn)物進行濃度(采用Qubit dsDNA BR 分析試劑盒分析)和瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢,合格后使用Sequel Ⅱ Sequencing Plate 2.0軟件(PacBio公司)進行測序分析。

1.3.3.3AlphaFold建模模擬蛋白質(zhì)表達 將已經(jīng)獲取的蛋白質(zhì)序列fasta文件格式下載,然后提交至超算中心進行Aphafold建模,建模完成后,產(chǎn)生模型。構(gòu)建的模型經(jīng)過多次優(yōu)化完成后,需要對其結(jié)構(gòu)進行評估。拉氏圖評價方法用以表明蛋白質(zhì)中氨基酸的允許和不允許構(gòu)象。主鏈構(gòu)型中的φ,ψ二面角可從拉氏圖中讀出,當不低于 90%的φ,ψ二面角分布在允許區(qū)的時候則表明模型合理。使用Alphafold 在線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://github.com/deepmind/alphafold)預(yù)測蛋白質(zhì)中每對氨基酸之間的距離分布,以及連接它們的化學(xué)鍵之間的角度,從而構(gòu)建蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1血型血清學(xué)結(jié)果 先證者RhD初篩結(jié)果為鹽水弱凝集(1+),IAT 凝集強度顯示4+。Rh系統(tǒng)其他抗原表型為Ccee。父親(Ⅰ1)和母親(Ⅰ2)RhD初篩結(jié)果為陽性,Rh系統(tǒng)其他抗原表型分別為CcEe和Ccee;所有樣本直接抗人球蛋白試驗、抗篩試驗及抗體鑒定試驗均為陰性。血型血清學(xué)檢測結(jié)果見表1。

表1 各樣本血型血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2D抗原表位分析結(jié)果 D抗原表位檢測結(jié)果見表2。先證者紅細胞與epD8.2抗體無凝集反應(yīng),與其他抗原表位反應(yīng)呈弱凝集。其父母的紅細胞與針對D抗原的epD6.6、epD6.4、epD5.4、epD8.2、epD9.1、epD2.1和epD3.1表位的單克隆抗-D反應(yīng)呈強陽性(3+～4+)。

表2 D抗原表位反應(yīng)格局

2.3RHD基因初分型結(jié)果 先證者(Ⅱ1)及其父親(Ⅰ1)、母親(Ⅰ2)RHD基因初分型結(jié)果見圖1。

注:1泳道對應(yīng)外顯子1特異性檢測,分子量大小為132 bp;2泳道對應(yīng)外顯子5特異性檢測,分子量大小為157 bp;3泳道對應(yīng)外顯子6特異性檢測,分子量大小為132 bp;4泳道對應(yīng)外顯子7特異性檢測,分子量大小為287 bp;5、6泳道分別對應(yīng)845A和845G位點特異性檢測,分子量大小為188 bp;7～8泳道顯示1227A和1227G的特異性檢測,分子量大小為348 bp和201 bp。圖1 PCR-SSP電泳檢測結(jié)果

2.4基因測序結(jié)果 Sanger測序結(jié)果顯示先證者外顯子3的365位存在C>T純合錯義突變(圖2B),其他序列與正常RHD基因一致。其父親外顯子3的365位存在C>T的雜合錯義突變(圖2 A),其他序列與正常RHD基因一致。SMRT單倍型測序結(jié)果顯示其母親檢測出1條完整的RHD基因序列,而另外1條染色體上發(fā)生了RHD基因的全缺失(圖2 C)。

注:由于Sanger測序無法分開測定兩條染色體的基因型,無法確定樣本Ⅰ2的隱性基因型,故對進行SMRT單倍型測序分析。圖2 樣本Ⅰ1和Ⅱ1的RHD外顯子測序結(jié)果

2.5先證者的家系結(jié)果 家系調(diào)查顯示先證者父親(Ⅰ1)基因型為RHD*01/RHD*weak D type 54;先證者母親(Ⅰ2)基因型為RHD*01/RHD*01N.01。先證者(Ⅱ 1)RHD基因第3外顯子第122位堿基 C>T突變遺傳自其父親,RHD基因全缺失的染色體遺傳自其母親,其基因型為RHD*weak D type 54/RHD*01N.01。見圖3。

注:空白區(qū)域表示D陽性基因,陰影區(qū)域表示D陰性基因,斜線區(qū)域表示弱D54基因。圖3 該家系圖譜

2.6AlphaFold模擬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 由Aphafold構(gòu)建出先證者的RhD抗原突變前后的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型,見圖4。突變后,絲氨酸變?yōu)榱涟彼?且無法再與GLU146位形成氫鍵,進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

注:野生型RHD蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)骨架中N原子與MET118形成氫鍵,骨架中O原子與蛋白SER126形成兩根氫鍵,絲氨酸的酚羥基與蛋白GLU146形成氫鍵,其氫鍵的距離為3.0、3.2、3.1和3.3?。圖4 突變前后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部的改變

3 討論

Rh抗原受RHD、RHCE、RHAG基因調(diào)控,RhD和RhCE蛋白僅有33個氨基酸的差異,而位于細胞膜外的氨基酸僅有7個不同[4]。因RHD和RHCE基因的高度相似性,常會發(fā)生編碼基因的交換和融合,使表達的蛋白質(zhì)缺乏某些抗原表位,影響血型鑒定[6-8]。本研究中樣本Ⅱ1 RhD血清學(xué)結(jié)果初篩為弱陽性(1+),父母均為陽性。D-screen抗原表位分析發(fā)現(xiàn)樣本Ⅱ 1與D抗原的其他8種表位呈弱凝集反應(yīng),而與epD8.2無凝集反應(yīng)(表2)。推測此樣本不僅D抗原數(shù)量減少,還有部分表位缺失。

筆者利用PCR-SSP方法對其家系成員進行RHD基因分型,結(jié)果均為RHD基因陽性。由于基因分型結(jié)果與血清學(xué)結(jié)果不一致,對其家系成員進行RHD基因1～10外顯子測序。筆者發(fā)現(xiàn)Ⅰ1為弱D54等位基因攜帶者且有雜合峰,而Ⅱ1基因型為弱D型54,在RHD基因測序時均未見雜合峰,推測其僅有1條RHD基因。進一步通過三代測序?qū)Β?的RHD基因分型顯示其存在1條RHD基因,另外1條缺失,家系調(diào)查結(jié)果符合遺傳規(guī)律。

RhD蛋白的抗原性除了與氨基酸序列相關(guān)外,還取決于其復(fù)雜的空間構(gòu)象[4]。通過AlphaFold進行三維建模,提示野生型蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中第122位是極性不帶電的絲氨酸,RHD基因第365位堿基發(fā)生C>T突變,使第122位氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?大而非極性帶電的亮氨酸并不能與GLU146形成氫鍵相互作用。這些氨基酸的分子間相互作用力減弱后,可能會導(dǎo)致RhD蛋白與膜的結(jié)合受阻,引起D抗原數(shù)量的減少。

目前國際輸血協(xié)會數(shù)據(jù)庫中已列出約163種弱D表型(http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cellimmunogenetics-and-blood-groug-terminolter),其中弱D1型、D2型、D3型、D4型約占弱D表型的95%[6],通常不會引起同種免疫反應(yīng)[9]。南京地區(qū)發(fā)現(xiàn)的血清學(xué)弱D表型經(jīng)分子生物學(xué)鑒定大多數(shù)是弱D型15[10],而弱D型 54目前僅在上海、遼寧及山東地區(qū)進行RHD陰性獻血者的基因分析時發(fā)現(xiàn)并報道過5例[9-13]。RHD*weak D type 54等位基因(c.365C>T,p. Ser122Leu)于2006年在GenBank發(fā)布(登記號:AM396583),隨后被 ISBT 命名。葉璐夷等[11]研究指出Rh其他分型為Ccee的弱D型54型具有部分D表型的特性,可能引起同種免疫反應(yīng)。弱D免疫原性不強,一般不能使Rh陰性受血者產(chǎn)生抗-D,但其反應(yīng)性強,可被血漿中的抗-D快速破壞,引起嚴重溶血性輸血反應(yīng)[14]。因此,血清學(xué)弱D表型的獻血者應(yīng)作為D抗原陽性對待,而受血者應(yīng)視為RhD陰性[15],需要對RhD變異型進行分子生物學(xué)檢測。

在實際工作中,大型醫(yī)院的臨床標本量很多,幾乎都采用全自動血型儀進行術(shù)前血型鑒定(微柱凝膠法),如果沒有用鹽水法復(fù)核可能會造成漏檢。此外,雖然可用不同的克隆株鑒定30種D抗原表位[16],但仍有一些罕見的變異型無法檢出。臨床可用分子生物學(xué)技術(shù)進行鑒定,結(jié)合Alphafold預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),有助于探討D變異型的分子機制,揭示中國人群RHD基因的多態(tài)性,實現(xiàn)精準輸血。另一方面,傳統(tǒng)方法在罕見的RH血型中不容易分析,而三代測序可以將可能存在的重組形式清晰地分析出來,可以將之前無法準確判斷的情況在新方法下明確出來。目前三代靶向測序的成本進一步降低,也有利于未來臨床的廣泛應(yīng)用。當然,本研究也存在不足之處,如沒有闡明弱D型 54中可能的部分D型的分子機制,缺乏對溶血程度的統(tǒng)計分析,有待于對同樣表型的樣本進行系統(tǒng)性研究。