吳躍明,樓天正,徐俊龍(麗水市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,浙江麗水 323000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是重癥醫(yī)學領(lǐng)域的常見疾病,革蘭陰性桿菌感染是引起ALI/ARDS的主要原因之一。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌細胞壁的重要成分,研究證實,LPS作用于肺泡上皮細胞并引起炎癥反應及凋亡的過度激活,是導致ALI/ARDS的重要生物學環(huán)節(jié)[1-2]。LPS刺激肺泡上皮細胞是目前臨床上研究ALI及ARDS的常用細胞模型[3-4],研究LPS誘導肺上皮細胞炎癥反應及凋亡激活的分子機制有助于深入認識ALI/ARDS的病理生理機制。成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)是一種受體酪氨酸激酶,參與細胞凋亡與增殖、炎癥反應、血管生成等生物學環(huán)節(jié)的調(diào)控。有學者通過對腎損害及肝損害的細胞實驗證實,磷酸化FGFR1(p-FGFR1)的表達水平在LPS誘導的腎小管上皮細胞損傷模型及肝細胞損傷模型中均明顯增加,并進一步證實了FGFR1磷酸化的選擇性抑制劑AZD4547可顯著減輕LPS誘導的腎小管上皮細胞損傷和肝細胞損傷[5-6]。為深入認識FGFR1在ALI/ARDS中的生物學作用,本研究擬通過在LPS誘導肺上皮細胞炎癥反應及凋亡激活的模型中觀察FGFR1的表達水平變化,以及FGFR1抑制劑AZD4547對炎癥反應及凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1細胞系、儀器與試劑 人肺泡上皮細胞系Beas-2B購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。LPS、FGFR家族抑制劑AZD4547(美國Sigma公司),細胞裂解液、核蛋白提取試劑盒、CCK8法細胞增殖檢測試劑盒、Tunel法細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物科技公司),小鼠抗人FGFR1、p-FGFR1、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、p65 NF-κB、核纖層蛋白B(Lamin B)、β微管蛋白(β-Tubulin)單克隆抗體(美國Abcam公司),TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA法試劑盒(上海酶聯(lián)科技公司)。150i型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),FLX800型酶標儀(美國Bio-tek公司),GenoSens 2000型凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 取生長狀態(tài)良好的人肺泡上皮細胞系Beas-2B,常規(guī)細胞復蘇后在含10%胎牛血清的BEGM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng),每2天更換1次培養(yǎng)基,當細胞融合度達80%～90%時,用2.5 g/L胰蛋白酶消化90 s,1 000 r/min離心10 min后棄去上清,收集細胞沉淀,按照1∶2比例傳代。傳代后的細胞根據(jù)不同實驗目的,接種至不同規(guī)格培養(yǎng)板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),貼壁24 h后進行分組給藥。對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理,LPS組用含5 mg/L LPS的培養(yǎng)基處理,建立LPS誘導肺上皮細胞炎癥反應及凋亡激活的模型,不同濃度的AZD4547組用含5 mg/L LPS及2.5、5.0、10.0 μmol/L AZD4547的培養(yǎng)基處理。每組均在連續(xù)給藥處理24 h后進行相關(guān)指標檢測。

1.2.2總蛋白、核蛋白提取 按照1×105個/孔的細胞密度將Beas-2B細胞接種至12孔培養(yǎng)板中,按照1.2.1的方法分組給藥,處理24 h后收集細胞,加入預冷的細胞裂解液100 μL,在冰上裂解并提取總蛋白質(zhì),采用核蛋白提取試劑盒分離核蛋白,采用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度檢測結(jié)果,取20 μg蛋白質(zhì)用于Western blot。

1.2.3Western blot檢測

1.2.3.1總蛋白中p-FGFR1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的檢測 配制10% SDS-PAGE分離膠,將總蛋白質(zhì)樣品按200 μg的量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用100 V電壓20 min,分離膠采用120 V電壓70 min)。電泳結(jié)束后在350 mA恒流條件下(100 V、90 min)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉1 h,洗膜3次后將硝酸纖維素膜置于小鼠抗人FGFR1(1∶600稀釋)、p-FGFR1(1∶400稀釋)、Bcl-2(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)、cleaved caspase-3(1∶500稀釋)、β-Tubulin(1∶2 000稀釋)單克隆抗體,4 ℃溫育過夜;次日,洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(1∶2 000稀釋)室溫溫育硝酸纖維素膜1 h,在凝膠成像系統(tǒng)中進行化學顯影,用Image J軟件掃描蛋白質(zhì)條帶的灰度值,以β-Tubulin為內(nèi)參照,按照目標蛋白灰度值/β-Tubulin灰度值計算FGFR1、p-FGFR1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表達水平。每組重復4次。

1.2.3.2核蛋白中p65 NF-κB表達的檢測 配制10% SDS-PAGE分離膠,將核蛋白樣品按200 μg的量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、洗膜條件同上。將硝酸纖維素膜置于小鼠抗人p65 NF-κB(1∶1 000稀釋)、Lamin B(1∶3 000稀釋)單克隆抗體過夜,次日,洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(1∶2 000稀釋)室溫溫育硝酸纖維素膜1 h,在凝膠成像系統(tǒng)中進行化學顯影,用Image J軟件掃描蛋白質(zhì)條帶的灰度值,以Lamin B為內(nèi)參照,按照p65 NF-κB灰度值/Lamin B灰度值計算p65 NF-κB的表達水平。每組重復4次。

1.2.4CCK8法檢測細胞增殖能力 按照5×103個/孔的細胞密度將Beas-2B細胞接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔體積100 μL,貼壁培養(yǎng)24 h后按照1.2.1的方法分組給藥,處理24 h后在每個培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用FLX800型酶標儀檢測各個培養(yǎng)孔450 nm波長的吸光度(A450 nm)值。每組重復4次。

1.2.5Tunel法檢測細胞凋亡 按照5×104個/孔的密度將Beas-2B細胞接種至12孔培養(yǎng)板中,每孔體積0.5 mL,貼壁培養(yǎng)24 h后按照1.2.1的方法分組給藥,處理24 h后棄去培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛固定細胞2 h,按照Tunel試劑盒說明書進行細胞凋亡率檢測,用抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下隨機觀察3個高倍視野,對視野內(nèi)Tunel陽性細胞和DAPI陽性細胞進行計數(shù),計算兩者比值即為細胞凋亡率。每組重復4次。

1.2.6ELISA法檢測細胞因子含量 按照105個/孔的細胞密度將Beas-2B細胞接種至12孔培養(yǎng)板中,每孔體積1.0 mL,貼壁培養(yǎng)24 h后按照1.2.1的方法分組給藥,處理24 h后收集培養(yǎng)基,按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA法試劑盒及FLX800型酶標儀說明書操作檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度;提取細胞總蛋白,采用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。計算培養(yǎng)基細胞因子濃度/細胞總蛋白濃度的比值作為細胞因子的含量。每組重復4次。

2 結(jié)果

2.1western blot檢測各組p-FGFR1的表達水平 對照組、LPS組以及2.5、5、10 μmol/L AZD4547組Beas-2B細胞中p-FGFR1的表達水平分別為0.29±0.06、1.05±0.12、0.86±0.07、0.67±0.05和0.44±0.06,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=65.083,P<0.05)。進一步進行組間兩兩比較結(jié)果表明,LPS組Beas-2B細胞中p-FGFR1的表達水平顯著高于對照組(t=11.329,P<0.05);而2.5、5、10 μmol/L濃度AZD4547組Beas-2B細胞中p-FGFR1的表達水平低于LPS組(t分別為2.735、5.846、9.690,P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot檢測各組p-FGFR1的表達水平

2.2CCK8法檢測各組細胞增殖能力 對照組、LPS組以及2.5、5、10 μmol/L AZD4547組Beas-2B細胞A450 nm值分別為1.05±0.11、0.36±0.05、0.55±0.06、0.72±0.06和0.93±0.10,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=45.012,P<0.05)。進一步進行組間兩兩比較結(jié)果表明,LPS組顯著低于對照組(t=11.421,P<0.05);而2.5、5、10 μmol/L濃度AZD4547組Beas-2B細胞的A450 nm水平顯著高于LPS組(t分別為8.111、9.218、10.197,P<0.05)。

2.3Tunel法檢測各組的細胞凋亡率 對照組、LPS組以及2.5、5、10 μmol/L AZD4547組Beas-2B細胞凋亡率(%)分別為5.41±0.72、29.41±5.21、20.12±3.21、13.22±1.94、8.48±0.94,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=43.527,P<0.05)。進一步進行組間兩兩比較結(jié)果表明,LPS組Beas-2B細胞的凋亡率高于對照組(t=9.126,P<0.05);而2.5、5、10 μmol/L濃度AZD4547組Beas-2B細胞的凋亡率低于LPS組(t分別為3.036、5.824、7.907,P<0.05)。見圖2。

圖2 Tunel法檢測對照組、LPS組、AZD4547組的細胞凋亡率

2.4Western blot 檢測各組凋亡蛋白的表達 LPS組Beas-2B細胞總蛋白中Bax、cleaved caspase-3水平顯著高于對照組,而Bcl-2水平低于對照組(P<0.05);此外,2.5、5、10 μmol/L濃度AZD4547組Beas-2B細胞總蛋白中Bax、cleaved caspase-3水平顯著低于LPS組,而Bcl-2蛋白水平高于LPS組(P<0.05)。見圖3、表1。

表1 各組細胞總蛋白中凋亡蛋白表達水平的比較

圖3 Western blot檢測各組Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達

2.5ELISA法檢測各組炎癥細胞因子的含量 LPS組Beas-2B細胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量顯著高于對照組(P<0.05);而2.5、5、10 μmol/L濃度AZD4547組Beas-2B細胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量顯著低于LPS組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞培養(yǎng)基中炎癥細胞因子含量的比較

2.6Western blot檢測抑制p-FGFR1對LPS刺激Beas-2B細胞模型中NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響 對照組、LPS組及2.5、5、10 μmol/L AZD4547組Beas-2B細胞核蛋白中p65 NF-κB的表達水平分別為0.10±0.02、0.94±0.11、0.74±0.08、0.41±0.06和0.28±0.04,各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=102.515,P<0.05)。進一步進行組間兩兩比較結(jié)果表明,LPS組Beas-2B細胞核蛋白中p65 NF-κB水平顯著高于對照組(t=15.027,P<0.05);而2.5、5、10 μmol/L濃度AZD4547組Beas-2B細胞核蛋白中p65 NF-κB水平顯著低于LPS組(t分別為2.941、8.460、11.278,P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測各組p65 NF-κB的表達水平

3 討論

LPS誘導肺泡上皮細胞炎癥反應和凋亡是ALI/ARDS發(fā)病的重要病理生理特征。5 mg/L LPS刺激肺泡上皮細胞是研究ALI/ARDS常用的細胞模型[3-4,7-8]。本研究中采用5 mg/L LPS刺激肺泡上皮細胞系Beas-2B后細胞增殖活力減弱,凋亡率及炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6均增加,表明LPS刺激引起肺泡上皮細胞損傷、導致炎癥反應及凋亡激活,與既往其他研究的報道基本一致。

本研究進一步在該細胞模型中分析FGFR1的生物學作用。研究表明,FGFR1磷酸化為p-FGFR1后參與炎癥反應及細胞凋亡的調(diào)控[9-11]。在LPS誘導牙周炎模型及內(nèi)毒素血癥小鼠模型中均發(fā)生了FGFR1的過度磷酸化[12-13]。本研究結(jié)果顯示,LPS刺激肺泡上皮細胞后p-FGFR1表達水平增加,表明在LPS刺激肺泡上皮細胞系Beas-2B的ALI/ARDS細胞模型中存在FGFR1的過度磷酸化,提示FGFR1的磷酸化可能參與LPS誘導肺泡上皮細胞炎癥反應及凋亡激活的過程。

AZD4547是FGFR1磷酸化的選擇性抑制劑,Lou等[5]和Chen等[6]的研究均使用AZD4547抑制FGFR1的磷酸化,二者的研究結(jié)果顯示,在LPS誘導肝細胞和腎小管上皮細胞損傷模型中AZD4547顯著減輕細胞損傷并抑制炎癥反應及細胞凋亡。本研究在LPS刺激肺泡上皮細胞的同時使用不同濃度AZD4547進行干預,結(jié)果顯示AZD4547以濃度依賴性的方式削弱LPS抑制細胞增殖、促進炎癥反應細胞凋亡的作用,這進一步提示了LPS通過促進FGFR1的磷酸化誘導肺泡上皮細胞炎癥反應及凋亡的激活。

研究證實,FGFR1調(diào)控炎癥反應的下游途徑是NF-κB[14-15],調(diào)控細胞凋亡的下游途徑是線粒體凋亡途徑[16-18]。本研究的檢測結(jié)果顯示,LPS刺激肺泡上皮細胞后總蛋白中Bcl-2的表達降低,總蛋白中Bax、cleaved caspase-3及核蛋白中NF-κB的表達增加。NF-κB入核后能夠促進多種促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄并激活炎癥反應[14-15];線粒體凋亡途徑中Bcl-2/Bax表達水平的變化與線粒體膜對細胞色素C的通透性有關(guān),進入細胞漿的細胞色素C通過級聯(lián)反應促進cleaved caspase-3的生成,進而介導細胞凋亡[16-18]。ALI/ARDS發(fā)病過程中NF-κB通路介導的炎癥反應、Bcl-2/Bax介導的線粒體凋亡途徑均存在相應變化[19],與本研究的結(jié)果相吻合。

為進一步認識FGFR1磷酸化在LPS誘導肺泡上皮細胞炎癥反應及凋亡激活中的作用,本研究的分析結(jié)果顯示,不同濃度AZD4547能夠以濃度依賴性的方式削弱LPS刺激對Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及NF-κB的調(diào)控作用。這一結(jié)果不僅驗證了FGFR1磷酸化參與LPS誘導肺泡上皮細胞炎癥反應及凋亡的激活,還揭示了p-FGFR1發(fā)揮作用的下游途徑是NF-κB炎癥途徑及Bax/Bcl-2線粒體凋亡途徑。然而,本研究雖通過細胞實驗證實FGFR1過度磷酸化與LPS誘導肺上皮細胞炎癥反應及凋亡激活有關(guān),但關(guān)于FGFR1在ALI/ARDS中的生物學作用尚缺乏動物實驗驗證,這是本研究的不足之處。