李佳樂,高雯(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科,南京 210029)

理想的癌癥治療方法不僅可以殺死惡性腫瘤細胞,還可以保留健康組織細胞。越來越多的臨床試驗證實,免疫治療對多種腫瘤有效,特別是對于晚期實體瘤,免疫療法已成為無驅(qū)動基因改變腫瘤患者的一種有前途的治療方法[1-3]。在這個精準醫(yī)療的時代,需要利用對癌癥生物學和基因組學的更好理解來開發(fā)免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的預測性生物學標志物,識別有益臨床反應和不良事件風險低的患者,以便患者獲益。生物學標志物還將有助于確定適合ICIs的患者,以及決定其應該接受單一療法還是聯(lián)合療法。為了更好地區(qū)分對腫瘤免疫治療敏感患者和非敏感患者,科學家們迫切需要尋找可靠的生物學標志物。程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)、腫瘤突變負荷(tumor mutational burden,TMB)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)等已被證實可以作為預測患者對ICIs治療反應的生物學標志物[4-5]。筆者介紹一種來源于病毒致癌蛋白或非同義體細胞突變的新生抗原(neoantigen),并證實TMB和MSI均是新生抗原的間接檢測指標[6]。新生抗原的特異性識別在抗腫瘤免疫應答中起著重要作用,新生抗原可能是ICIs的一種新興的預測生物學標志物。筆者總結(jié)了新生抗原預測生物學標志物的特點,并討論了新生抗原在免疫治療中的應用。

1 新生抗原的定義

腫瘤抗原是腫瘤細胞產(chǎn)生的抗原物質(zhì),可引發(fā)宿主的免疫反應,目前共發(fā)現(xiàn)有15種腫瘤抗原。根據(jù)特異性,腫瘤抗原可分為腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAA)、病毒抗原(virus antigen)、腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen,TSA)和非傳統(tǒng)腫瘤抗原(unconventional tumor antigens)[7]。

腫瘤特異性抗原也稱為新生抗原,它來源于體細胞突變或基因重排蛋白,在單個腫瘤組織中過度表達,可以被T細胞受體特異性識別,包括單個核苷酸突變來源抗原(single nucleotide variants-derived neoantigens),插入突變來源抗原(indel-derived neoantigens),基因融合來源抗原(gene fusion-derived neoantigens),mRNA剪切異常來源抗原(splice variant-derived neoantigens),未注釋開放閱讀框架來源抗原(translated unannotated ORFs derived neoantigens),線粒體基因組來源抗原(mitochondrial genome derived neoantigens)和熱點突變類抗原(hotspot mutation derived neoantigens)[5,8]。圖1介紹了不同腫瘤類型形成新生抗原的可能性[3]。與未突變的自身抗原相比,新生抗原真正區(qū)別于正常組織,可使免疫系統(tǒng)識別為非自身抗原,避免了自身免疫的風險[7]。新生抗原是由脫氧核苷酸(deoxyribonucleic acid,DNA)損傷和/或DNA修復機制的隨機錯誤引起的零星突變的結(jié)果,且腫瘤的新生抗原不能在患者之間共享,這意味著每個癌癥患者都有其獨特的基因突變,這一個體特異性特征將新生抗原與個體間共享的其他腫瘤抗原區(qū)分開來[5]。新生抗原在正常組織中表達很少或沒有表達,這預示著新生抗原可能是免疫治療的潛在靶點,具有高特異性、高有效性和高安全性[9-10]。

注:任何形式的基因組不穩(wěn)定都可能導致新生抗原的產(chǎn)生。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工,多肽與MHC結(jié)合,組裝的p-MHC遞呈至細胞表面誘導T細胞的激活。圖1 新生抗原的來源示意圖

2 新生抗原的優(yōu)勢與不足

隨著對腫瘤免疫治療的認識,人們發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生持久抗腫瘤反應的淋巴細胞大多針對突變基因產(chǎn)生的新生抗原。細胞介導免疫是抗腫瘤免疫應答的主要機制。在這個過程中,體細胞突變產(chǎn)生突變抗原,這些抗原加工成肽,然后該肽與主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)結(jié)合,組裝好的肽-MHC (peptide-MHC,p-MHC)被呈現(xiàn)至細胞表面,誘導T細胞啟動和激活。T細胞通過T細胞受體(T cell receptor,TCR)和p-MHC的相互作用,特異性識別和結(jié)合腫瘤細胞。新生抗原被識別后,腫瘤細胞被腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)殺死[6]。

由于新生抗原在免疫反應中的特殊性,其在免疫治療中的潛在預測價值引起了許多人的興趣,并開展了各種各樣的研究。越來越多的證據(jù)證明,新生抗原與延長患者生存期相關(guān),新生抗原可以成為預測ICIs療效的生物學標志物[11]。關(guān)于新生抗原的不足主要為檢測技術(shù)的敏感性低和細胞用量大[12-15]。對于無法手術(shù)的晚期腫瘤患者,穿刺所獲得的新鮮腫瘤組織可能無法獲得足夠的細胞量以檢測新生抗原[12]。

3 新生抗原的檢測方法

新生抗原是腫瘤細胞中突變基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯,包括編輯和修飾,合成的多肽,然后新生抗原被MHC分子識別,在細胞表面加工表達,最后遞呈給T細胞。T細胞受體識別特異性p-MHC復合體(MHC Ⅰ呈現(xiàn)給CD8+T細胞,MHC Ⅱ呈現(xiàn)給CD4+T細胞),然后誘導特異性T細胞擴增和免疫應答。概括地說,對新生抗原的檢測需要通過3個條件:突變(單個氨基酸突變、移碼突變、基因融合、可變剪切、熱點突變等),特異性T細胞免疫應答,加工遞呈(腫瘤細胞將突變蛋白加工、遞呈給MHC,以p-MHC的形式存在于細胞膜表面)。其中關(guān)鍵的步驟是如何驗證新生抗原的免疫原性、特異性反應和能否被內(nèi)源性加工遞呈。由于不是所有的非同義突變都能產(chǎn)生T細胞識別的產(chǎn)物,而且免疫原性也不一致,因此識別能引起免疫反應的新生抗原具有很高的價值[16]。通過下一代測序(next-generation sequencing,NGS)發(fā)現(xiàn)腫瘤突變,然后通過生物信息法預測新抗原,最后采用傳統(tǒng)的免疫學方法篩選和證明新抗原。目前有兩種檢測方法:間接檢測法和直接檢測法[7,12-15,17-22]。見圖2。

注:直接檢測法和間接檢測法。圖2 新生抗原的檢測示意圖

3.1間接檢測法 Robbins等[17]在TIL療法的研究中曾報道過新生抗原的檢測方式,主要分為五步:外顯子測序腫瘤原代細胞系、突變分析、預測特定HLA與突變抗原結(jié)合的親和性、合成親和力高的肽、T細胞反應分析。該學者首先將測序與突變分析的基因序列用生物學信息軟件NetMHCPan 2.4(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)進行親和力預測,將親和力高的肽加載至抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APC),與回輸?shù)腡IL細胞共育,然后用ELISA法檢測IFN-γ識別出能刺激TIL特異性反應的肽,這是對突變肽免疫原性評價。進一步對特異性反應檢測,尋找基因的突變位點,分別轉(zhuǎn)錄、翻譯野生型肽與突變型肽。隨著APC加載肽的濃度增加,具有特異性反應的突變肽可以刺激TIL細胞產(chǎn)生更多的IFN-γ,而野生型肽無法檢測出增加的IFN-γ。進一步將APC轉(zhuǎn)染具有突變基因的表達質(zhì)粒,與TIL共育,檢測IFN-γ以驗證突變抗原能否被內(nèi)源性加工提呈。通過上述步驟,Robbins等[17]識別出至少3種新生抗原。間接檢測法可以概括為以下幾步:首先,通過腫瘤細胞和正常細胞的全基因組測序或外顯子測序識別腫瘤中的非同義突變(non-synonymous mutation,NSM),并將其作為候選新生抗原,其中RNA測序可以作為反向鑒定的替代方法。然后根據(jù)候選新生抗原的免疫原性進行進一步篩選,將TIL與第一步識別的非同義突變合成的所有候選新生抗原共培養(yǎng)。候選新生抗原的免疫原性可以通過評估T細胞的反應來確定。這種方法主要適用于突變數(shù)量有限的腫瘤。通過現(xiàn)有的預測算法可以篩選出與MHC分子更有親和力的多肽,該算法可以根據(jù)肽加工、運輸和與MHC Ⅰ結(jié)合步驟的生化和生物物理特性,優(yōu)先考慮更有可能出現(xiàn)在MHC Ⅰ上的候選多肽。因此,現(xiàn)有的預測算法大多是針對MHC Ⅰ限制性肽的預測。雖然預測算法已經(jīng)取得了很大的進步,但由于預測算法不能將影響免疫原性的所有因素都考慮在內(nèi),預測的準確性還需要進一步提高[7,12-13]。另一方面,這些算法建立在每個開發(fā)人員設置的特征的基礎上,因此最終的結(jié)果可能不一致。如何協(xié)調(diào)和建立統(tǒng)一的標準,仍然是一個有待解決的問題。

3.2直接檢測法 體內(nèi)T細胞通過TCR識別p-MHC發(fā)揮免疫作用,MHC結(jié)合的肽是T細胞治療最核心的靶點?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的蛋白質(zhì)組學可以直接鑒定與MHC分子TCR結(jié)合的肽段。首先將腫瘤細胞裂解,通過抗MHC抗體富集p-MHC,洗脫與MHC分子結(jié)合的肽段,然后鑒定被洗脫肽段的氨基酸序列。下一步采用預測算法或評估T細胞反應性以確定候選新生抗原的免疫原性,并確定真正的免疫原性新生抗原[14-15,22]。通過質(zhì)譜方式獲得抗原,極大地提高了MHC Ⅰ類新生抗原預測的準確性,并且通過深度學習可以提高MHC Ⅱ類新生抗原的準確性[13-15]。然而,這種方法在實踐中可能會出現(xiàn)錯誤[7,23]。盡管技術(shù)進步很大,但免疫治療的預測對新生抗原的準確識別有更高的要求。

4 新生抗原的臨床應用

新生抗原的腫瘤治療性疫苗有多種形式,如肽疫苗、RNA疫苗、樹突狀細胞(dendritic cells,DC)疫苗。新生抗原疫苗可以誘發(fā)和增強機體抗腫瘤免疫反應[24-25]。在過繼性細胞免疫(adoptive cell transfer,ACT)治療領(lǐng)域,通過篩選新生抗原可發(fā)現(xiàn)T細胞靶點,并在取得不錯的療效[18,20-21]。首個報告的新生抗原的T細胞受體(neoantigen-specific TCR,neoTCR)的細胞療法臨床研究已證明了其安全性[19],其他多種實體瘤的臨床試驗如NCT03412877還在進行中。

5 總結(jié)與展望

由于腫瘤免疫療法的療效僅限于一部分腫瘤患者,并且免疫治療可能誘發(fā)免疫相關(guān)不良事件,為了克服這些限制,識別ICIs的預測性生物學標志物迫在眉睫。本文討論的新生抗原是一種新的潛在的腫瘤免疫治療預測生物學標志物。新生抗原可能會是免疫治療的關(guān)鍵所在,筆者介紹了目前新生抗原識別的方法和技術(shù)。然而,在實際應用中,新生抗原的動態(tài)變異和潛在新生抗原的識別等障礙尚未克服,基于NGS和數(shù)據(jù)庫,建立和優(yōu)化多種新生抗原預測算法是必不可少的。