周梓婷,顏建業(yè),鄭智弦,翟勵(lì)敏(1.梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, b.腫瘤科,廣西梧州 54300;.桂林市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西桂林 541000)

食管癌屬于消化道惡性腫瘤,由于其發(fā)病早期癥狀不明顯,許多患者確診時(shí)病情已發(fā)展至中后期,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至生存時(shí)間,早期診斷和及時(shí)治療對(duì)食管癌患者預(yù)后良好及提高生活質(zhì)量水平具有重要意義[1]。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是臨床常用的腫瘤診斷方法,其用于監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生具有簡(jiǎn)便快速,經(jīng)濟(jì)無(wú)創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)[2]。腫瘤標(biāo)志物中的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)是臨床上常見(jiàn)的消化道腫瘤檢測(cè)指標(biāo)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),circAGFG1在多種惡性腫瘤中的表達(dá)上調(diào),其水平與宮頸癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的惡性程度呈正相關(guān),并可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4-5],但其在食管癌中的研究報(bào)道罕見(jiàn)。因此,本研究旨在檢測(cè)并分析食管癌患者血清circAGFG1的表達(dá)情況,評(píng)估其對(duì)食管癌患者預(yù)后的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2017年1月至2019年2月在梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院腫瘤科就診的100例食管癌患者作為研究對(duì)象,男52例,女48例,年齡(61.8±6.6)歲,以同期體檢健康者40例作為健康人對(duì)照組,男26例,女14例,年齡(59.7±6.1)歲,兩組在年齡和性別間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合臨床食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],并經(jīng)病理組織學(xué)確診為食管癌;(2)初診未接受過(guò)化療或手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有肝、腎等其他器官疾病;(2)患有其他惡性腫瘤、血液相關(guān)疾病等;(3)伴有慢性感染或急性感染者;(4)臨床病例資料不全者。以電話及門診復(fù)查的方式對(duì)所有食管癌患者隨訪3年,患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或因食管癌死亡則隨訪結(jié)束,患者隨訪率為100%。生存時(shí)間為術(shù)后日期至患者死亡時(shí)間或最終隨訪截止時(shí)間。本研究遵循《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》,并通過(guò)梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):20161208),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技公司),AFP、CEA、CA19-9、SCC及CYFRA21-1檢測(cè)試劑盒,Cobas e601羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(上海羅氏診斷產(chǎn)品公司),Life實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(珀金-埃爾默公司)。

1.3方法

1.3.1樣本采集 分別采用不含抗凝劑的試管采集食管癌患者住院第1天(治療前)和體檢健康者體檢時(shí)晨起空腹(禁食8～12 h)靜脈血4～6 mL,3 500 r/min離心15 min后取上層血清,置于-80 ℃保存。

1.3.2血清circAGFG1檢測(cè) 采用基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組血清circAGFG1的相對(duì)表達(dá)量。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取血清標(biāo)本中的總RNA樣本,通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度,取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為2.0,濃度>25 ng/μL的樣本,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA樣本置于-80 ℃保存。各引物由上海聯(lián)碩生物科技公司合成,并采用Primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)。circAGFG1 GenBank序列號(hào)為NM_004504.5,其上游引物序列:5′-CCAGTTGTAGGTCGTTCTCAAG-3′,下游引物序列:5′-GGATTTAATCCTCGCCTGCATG-3′,退火溫度為59 ℃,產(chǎn)物片段大小204 bp;GAPDHGenBank序列號(hào)為NM_001357943,其上游引物序列:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物序列:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,退火溫度為57 ℃,產(chǎn)物片段大小172 bp。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及Life實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為20 μL,包括:PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用Life實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件于72.5 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析,計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算circAGFG1的相對(duì)表達(dá)水平,ΔΔCt=(ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt健康人對(duì)照組),ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,每個(gè)Ct值為樣本重復(fù)檢測(cè)3次結(jié)果取均值。

1.3.3各腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 采用電化學(xué)發(fā)光法,按照全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及AFP、CEA、CA19-9、SCC及CYFRA21-1檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)食管癌患者和健康人對(duì)照組血清AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1的表達(dá)水平。AFP參考區(qū)間:0～25 ng/mL;CEA參考區(qū)間:0～4.7 ng/mL;CA19-9參考區(qū)間:0～40 U/mL;SCC參考區(qū)間:0～1.5 ng/mL;CYFRA21-1參考區(qū)間:0～3.3 ng/mL。

2 結(jié)果

2.1各組血清circAGFG1的表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清circAGFG1結(jié)果顯示,食管癌患者血清circAGFG1的表達(dá)水平(1.37±0.36)顯著高于健康人對(duì)照組(0.98±0.24),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.307,P<0.001)。

2.2血清circAGFG1水平與食管癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 食管癌患者血清circAGFG1水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),而與年齡、腫瘤直徑、吸煙等指標(biāo)無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 血清circAGFG1水平與食管癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3各組腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 食管癌患者血清AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1水平均顯著高于健康人對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 食管癌患者、健康人對(duì)照組各腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)水平比較

2.4不同生存期食管癌患者預(yù)后及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 生存組患者TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、CEA、SCC、CYFRA21-1、circAGFG1水平均顯著低于死亡組(P<0.05),而兩組患者在年齡、性別、吸煙史、腫瘤直徑、AFP、CA19-9水平之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同生存期食管癌患者預(yù)后情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5血清circAGFG1表達(dá)與食管癌患者3年生存率的關(guān)系 以食管癌患者血清circAGFG1水平的均值(1.37)為界值,將患者分為circAGFG1高表達(dá)組(32例)和circAGFG1低表達(dá)組(68例)。采用Kaplan-Meier法分析食管癌患者血清circAGFG1水平與預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示食管癌患者血清circAGFG1高表達(dá)患者的3年生存率為25.00%(8/32),顯著低于低表達(dá)患者的79.41%(54/68),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.506,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同血清circAGFG1水平食管癌患者的生存曲線分析

2.6食管癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析 以TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=1,Ⅲ～Ⅳ期=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)=1,有=0)、CEA(<4.61 ng/mL=1,≥4.61 ng/mL=0)、SCC(<1.64 ng/mL=1,≥1.64 ng/mL=0)、CYFRA21-1(<3.36 ng/mL=1,≥3.36 ng/mL=0)和circAGFG1(<1.37=1,≥1.37=0)為自變量,隨訪時(shí)間為時(shí)間變量,預(yù)后(生存=1,死亡=0)為因變量。多因素Cox回歸分析顯示,TNM分期、CEA、CYFRA21-1和circAGFG1為食管癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 多因素COX回歸分析食管癌患者預(yù)后的影響因素

3 討論

蔣之勝等[7]研究發(fā)現(xiàn),食管癌患者術(shù)前血清CYFRA21-1和CEA水平是預(yù)后生存的獨(dú)立影響因素,術(shù)前聯(lián)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物對(duì)食管癌患者生存預(yù)測(cè)具有較高的敏感性。本研究結(jié)果顯示,食管癌患者血清AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1水平均顯著高于健康人對(duì)照組,且生存組患者TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、CEA、SCC、CYFRA21-1水平顯著低于死亡組。多因素Cox回歸分析顯示,TNM分期、CEA、CYFRA21-1為食管癌患者預(yù)后的影響因素,與蔣之勝等[7]的研究結(jié)果相一致,提示腫瘤標(biāo)志物水平與食管癌病情發(fā)展密切相關(guān),對(duì)患者預(yù)后評(píng)估具有一定的價(jià)值。

circAGFG1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)并被研究的環(huán)狀RNA,在多種腫瘤組織中的表達(dá)異常,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)circAGFG1在食管癌組織中明顯上調(diào),circAGFG1可通過(guò)調(diào)控miR-4306/MAPRE2軸,促進(jìn)食管癌的進(jìn)展,并可作為ESCC治療和診斷的潛在生物標(biāo)志物[8]。本研究結(jié)果顯示,食管癌患者血清circAGFG1水平顯著高于健康人對(duì)照組,且其水平與食管癌患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),表明circAGFG1參與了食管癌的進(jìn)展,或可用于監(jiān)測(cè)臨床進(jìn)展情況。另外,本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),生存組circAGFG1水平顯著低于死亡組(P<0.05),且circAGFG1高表達(dá)患者的3年生存率(25.00%)顯著低于低表達(dá)患者(79.41%),表明circAGFG1是食管癌患者預(yù)后的影響因素,circAGFG1水平與食管癌病情進(jìn)展密切相關(guān),對(duì)患者預(yù)后評(píng)估具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是本研究未能進(jìn)一步探究circAGFG1水平與AFP、CEA、CA19-9、SCC、CYFRA21-1等腫瘤標(biāo)志物之間的區(qū)別,且未能采用ROC曲線對(duì)其診斷食管癌的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估,后續(xù)筆者將擴(kuò)大量樣本量,深入探究circAGFG1檢測(cè)對(duì)食管癌的臨床意義,并進(jìn)一步探討其與各種腫瘤標(biāo)志物的差異,以期為circAGFG1作為臨床評(píng)估食管癌預(yù)后標(biāo)志物提供有效依據(jù)。