丁玉重,文彩玲,牛鳳鶴(.濮陽市婦幼保健院孕產(chǎn)保健部,河南濮陽 457000;.南陽市第二人民醫(yī)院婦科,河南南陽 473000)

近年來,妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)發(fā)生率呈逐年上升趨勢,其可引發(fā)產(chǎn)后出血、胎兒窘迫等不良妊娠結(jié)局[1-2]。因此,尋找與GDM發(fā)病有關(guān)的指標,及時干預,對改善GDM妊娠結(jié)局有積極意義。研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-221(microRNA-221, miR-221)作為miRNA的一員,參與了GDM病理變化,其在GDM患者中呈低表達,miR-221可能通過影響胰島功能,進而影響GDM的發(fā)生、發(fā)展[3]。Gan等[4]發(fā)現(xiàn)miR-221-3p是miR-221家族的一員,其可靶向調(diào)控胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)表達。Balachandiran等[5]發(fā)現(xiàn)IGF-1在GDM患者中的表達水平升高,且證實IGF-1可能影響胎兒生長。但miR-221-3p在GDM患者中的表達水平及其與IGF-1、妊娠結(jié)局的關(guān)系目前尚不明確。因此,本研究通過測定miR-221-3p在GDM患者血清中的表達水平,以期探究miR-221-3p與IGF-1、妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2020年5月至2022年5月在濮陽市婦幼保健院孕產(chǎn)保健部足月分娩的血糖控制良好的GDM患者80例為GDM1組,產(chǎn)婦年齡為(28.6±4. 6)歲,BMI為(25.30±3.01)kg/m2;另選取同期足月分娩的血糖控制不良的GDM患者80例為GDM2組,產(chǎn)婦年齡(29.3±4.8)歲,BMI為(25.67±3.18)kg/m2。納入標準:(1)GDM1組、GDM2組患者均符合《妊娠期糖尿病診治指南》[6]中GDM的判定標準;(2)GDM1組患者FPG<5.3 mmol/L,進餐后1 h時血糖水平<7.8 mmol/L,2 h時血糖水平<6.7 mmol/L為血糖控制良好,GDM2組患者不符合上述標準記為血糖控制不良;(3)受試者對本研究知情同意,均為單胎妊娠;(4)受試者檢查資料完善;(5)足月分娩。排除標準:(1)孕前有糖尿病史者;(2)合并冠心病、高血壓等心血管疾病者;(3)患有多囊卵巢綜合征者;(4)合并肝腎功能障礙者;(5)使用激素類藥物或因其他因素引起血糖升高者。納入同期足月分娩的糖代謝正常的健康孕婦80例為健康人對照組,產(chǎn)婦年齡為(28.9±4.7)歲,BMI為(25.54±3.09)kg/m2。健康人對照組、GDM1組、GDM2組年齡、孕周比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究符合《赫爾辛基宣言》,且經(jīng)濮陽市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文號:202004005)。

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑 TaqManTMmiRNA ABC純化試劑盒和TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒(美國Invitrogen公司),miRNA qRT-PCR Kit(美國默克公司),人IGF-1 ELISA試劑盒(上海遠慕生物科技公司)。MyGo Pro qRT-PCR儀(英國IT-IS公司),UV1700紫外分光光度計(上海奧析科學儀器公司),BS-600M全自動生化分析儀(深圳邁瑞醫(yī)療公司),MultiskanFC酶標儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2.2樣本收集 留存所有受試孕婦在孕24～28周的空腹外周血4～5 mL,靜置45 min,4 800 r/min離心5 min,分離上清液(血清),分裝并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3檢測指標 收集所有受試者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、總膽固醇(TC)、舒張壓、三酰甘油(TG)、收縮壓、低/高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C/HDL-C)、產(chǎn)后出血、羊水過多、胎膜早破、巨大兒、胎兒窘迫、空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FBG)等臨床資料,其中血清指標TC、TG、LDL-C/HDL-C、FINS和FBG均使用BS-600M全自動生化分析儀及相應的試劑盒檢測,在檢測前使用校準品、質(zhì)控品對儀器進行定標質(zhì)量控制,根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型公式:胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FINS×FBG/22.5,計算HOMA-IR。

1.2.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清miR-221-3p表達水平 解凍血清,按照TaqManTMmiRNA ABC純化試劑盒說明書提取血清miRNA,使用UV1700紫外分光光度計檢測cDNA/RNA的濃度和純度,取吸光度(A260 nm/A280 nm)值在1.8～2.0之間,濃度>25 ng/μL的樣本,采用TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應,cDNA 樣本置于-80 ℃保存。miR-221-3p以U6為內(nèi)參,引物由上海生工公司合成,并采用Primer Express 3.0軟件設(shè)計。miR-221-3p上游引物序列:5′-GGCATGAACCTGGCATACAA-3′;下游引物序列:5′-TTTCCAGGTAGCCTGAAACCC-3′,GenBank序列號為NC_000023.11,退火溫度為53 ℃,產(chǎn)物片段大小124 bp;U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′;下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,GenBank序列號為NC_015438.3,退火溫度為58 ℃,產(chǎn)物片段大小106 bp。按照miRNA qRT-PCR Kit及MyGo Pro qRT-PCR儀說明書進行cDNA擴增,于72.5 ℃時采用儀器自帶軟件QuantStudio RT-PCR Software收集熒光信號并進行熔解曲線分析,檢測并計算基因循環(huán)閾值(Ct)。PCR反應體系:PCR Master Mix 20 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O補足至20 μL。循環(huán)參數(shù):98.2 ℃ 8 min;97.5 ℃ 30 s,56.5 ℃ 20 s,72.5 ℃ 15 s,共40個循環(huán)。miR-221-3p相對表達量以2-ΔΔCt法計算。ΔΔCt=(ΔCt實驗組-ΔCt健康人對照組),ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.2.5ELISA法檢測血清IGF-1水平 按照人IGF-1 ELISA試劑盒說明書配制IGF-1的標準品溶液,解凍血清,采用MultiskanFC酶標儀檢測IGF-1標準品溶液及待測血清在波長450 nm處的吸光度(A)值,繪制IGF-1標準曲線并計算血清IGF-1水平。

1.2.6生物信息學預測miR-221-3p與IGF-1的關(guān)系 采用Starbase生物信息學網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/)預測miR-221-3p與IGF-1的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1各組一般資料的比較結(jié)果 僅FBG、FINS及HOMA-IR在3組間的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步行組間兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),與健康人對照組相比,GDM1組、GDM2組患者FBG、FINS、HOMA-IR水平升高(P<0.05);而與GDM1組相比,GDM2組患者FBG、FINS、HOMA-IR水平升高(P<0.05);3組在年齡、體重指數(shù)、TC、TG、舒張壓、LDL、收縮壓、HDL水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料的比較結(jié)果

2.2各組血清miR-221-3p、IGF-1水平比較 血清miR-221-3p、IGF-1水平在3組間的表達水平差異均具有統(tǒng)計學意義(F分別為244.293和430.142,P<0.01);進一步進行組間兩兩比較結(jié)果表明,與健康人對照組相比,GDM1組、GDM2組患者血清miR-221-3p的表達水平降低(P<0.05),而IGF-1的表達水平升高(P<0.05);此外,與GDM1組相比,GDM2組患者血清miR-221-3p的表達水平降低(P<0.05),而IGF-1的表達水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清miR-221-3p、IGF-1水平比較

2.3GDM患者血清miR-221-3p、IGF-1水平與FBG、FINS、HOMA-IR的相關(guān)性 Pearson法分析顯示,GDM1組和 GDM2組患者血清miR-221-3p的表達水平與FBG、FINS、HOMA-IR均呈負相關(guān)(P<0.05),IGF-1水平與FBG、FINS、HOMA-IR均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3和表4。

表3 GDM1組患者血清miR-221-3p、IGF-1水平與FBG、FINS、HOMA-IR的相關(guān)性

表4 GDM2組患者血清miR-221-3p、IGF-1水平與FBG、FINS、HOMA-IR的相關(guān)性

2.4各組不良妊娠結(jié)局比較 與健康人對照組相比,GDM1組、GDM2組產(chǎn)后出血、羊水過多、胎膜早破、巨大兒、胎兒窘迫發(fā)生率顯著升高(P<0.05);此外,與GDM1組相比,GDM2組產(chǎn)后出血、羊水過多、胎膜早破、巨大兒、胎兒窘迫發(fā)生率顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組不良妊娠結(jié)局比較[n(%)]

2.5GDM患者血清miR-221-3p、IGF-1水平與妊娠結(jié)局的相關(guān)性 與未發(fā)生產(chǎn)后出血、羊水過多、胎膜早破、巨大兒、胎兒窘迫的GDM患者相比,發(fā)生以上不良妊娠結(jié)局的GDM患者血清miR-221-3p的表達水平顯著降低(P<0.05),而IGF-1的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表6。

表6 不同妊娠結(jié)局GDM患者血清miR-221-3p、IGF-1水平比較

2.6GDM患者血清miR-221-3p與IGF-1水平的相關(guān)性 Pearson法分析結(jié)果顯示,GDM1組與GDM2組患者血清miR-221-3p與IGF-1水平均呈負相關(guān)(r分別為-0.502,-0.415,P<0.05)。Starbase生物信息學分析結(jié)果顯示,miR-221-3p與IGF-1存在靶向結(jié)合位點。見圖1。

圖1 生物信息學分析miR-221-3p與IGF-1的靶向結(jié)合位點

3 討論

miR-221-3p通過與靶基因結(jié)合促進糖尿病傷口愈合,可作為治療糖尿病足潰瘍的潛在靶點[7]。另外,miR-221在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)中的表達水平降低,且與HOMA-IR呈負相關(guān),可能參與T2DM病理進展[8]。研究表明,IGF-1可維持血糖水平,影響血管新生,調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞浸潤,參與滋養(yǎng)細胞植入子宮蛻膜,調(diào)控胎兒生長發(fā)育,與妊娠結(jié)局關(guān)系密切[9-10]。既往報道顯示,IGF-1在GDM患者胎盤組織中的表達水平升高,可影響新生兒免疫功能,可能參與并影響GDM病變過程[11]。另外,何勤燕等[12]研究發(fā)現(xiàn),IGF-1在GDM患者中呈顯著高水平,且與巨大兒顯著有關(guān),可能會增加新生兒異常發(fā)生率。還有學者發(fā)現(xiàn), miR-221-3p可靶向調(diào)控IGF-1[4]。本研究中,GDM1組、GDM2組患者血清miR-221-3p的表達水平顯著低于健康人對照組,且GDM2組低于GDM1組;而血清IGF-1水平顯著高于健康人對照組,且GDM2組高于GDM1組,提示miR-221-3p和IGF-1可能參與了GDM發(fā)病過程,推測miR-221-3p通過靶向調(diào)節(jié)IGF-1,影響信號轉(zhuǎn)導,調(diào)控胰島β細胞的增殖、凋亡,進一步影響胰島功能,從而促進胰島素分泌,在GDM病變過程中起重要作用[13]。GDM患者體內(nèi)存在血糖紊亂,本研究顯示,健康人對照組、GDM1組、GDM2組FBG、FINS、HOMA-IR的表達水平逐漸升高,與孫露陽等[8]研究結(jié)果類似,且GDM2組患者血清FBG、FINS、HOMA-IR水平顯著高于GDM1組患者,GDM1組和GDM2組患者血清FBG、FINS、HOMA-IR與miR-221-3p水平均呈負相關(guān),而與IGF-1水平呈正相關(guān),提示miR-221-3p和IGF-1可能與GDM患者的胰島細胞功能顯著相關(guān),進一步證實了血清miR-221-3p水平隨胰島素分泌增加而降低,而IGF-1水平隨胰島素分泌增加而增加。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn)GDM2、GDM1組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率高于健康人對照組,且GDM2高于GDM1組,表明GDM可能使不良妊娠結(jié)局發(fā)生率增加,且血糖控制不良可能導致不良妊娠結(jié)局發(fā)生風險更高。進一步研究顯示,miR-221-3p在產(chǎn)后出血,羊水過多、胎膜早破、巨大兒、胎兒窘迫一系列不良妊娠結(jié)局的GDM患者血清中的表達水平顯著降低,而IGF-1在不良妊娠結(jié)局的GDM患者血清中的表達水平升高,提示miR-221-3p和IGF-1可能與GDM不良妊娠結(jié)局密切相關(guān),推測miR-221-3p通過調(diào)控IGF-1,調(diào)節(jié)胰島素功能,影響胰島素分泌,引起糖代謝紊亂,進而影響GDM患者妊娠結(jié)局,但具體機制仍需進一步探討。此外,經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),GDM1組、GDM2組患者血清miR-221-3p與IGF-1水平均呈負相關(guān);生物信息學檢索分析顯示,miR-221-3p與IGF-1存在靶向結(jié)合位點,提示miR-221-3p可能與IGF-1靶向結(jié)合,進而影響糖代謝及GDM的病理進展。但本研究尚未通過熒光素酶報告基因檢測等試驗進一步驗證miR-221-3p、IGF-1的關(guān)系,且未能深入探究GDM患者分娩前后血清miR-221-3p、IGF-1水平的動態(tài)變化以及未進一步分析影響GDM患者妊娠不良結(jié)局最緊密的指標,此為本研究不足之處。后續(xù)筆者將進一步增加樣本量,通過多元Logistic回歸及ROC曲線分析深入探究miR-221-3p和IGF-1對GDM患者妊娠結(jié)局的影響,并進一步分析二者關(guān)系,探究其影響GDM患者妊娠結(jié)局的作用機制,為將miR-221-3p、IGF-1水平作為GDM患者預測妊娠結(jié)局指標提供更充分的試驗依據(jù)。

綜上所述,GDM患者血清miR-221-3p的表達水平降低,而IGF-1的表達水平升高,且證實二者均與產(chǎn)后出血、羊水過多、不良妊娠結(jié)局有關(guān),表明miR-221-3p可能與IGF-1共同影響GDM患者的妊娠結(jié)局,為臨床診治GDM,降低不良妊娠結(jié)局發(fā)生率提供一定實驗指導。

作者貢獻聲明:丁玉重負責實驗操作,論文撰寫;文彩玲負責數(shù)據(jù)整理,統(tǒng)計學分析;牛鳳鶴負責論文修改,經(jīng)費支持。所有作者聲明無利益沖突。